Makrofaj Kolesterol tükenmesi ve Fagositoz Üzerine Etkisi Cryptococcus neoformans

Bu prosedürün genel amacı, cryptococcus neoformans'ın makrofajlar tarafından alımında kolesterolün rolünü aydınlatmaktır. Bu, ilk önce metil beta siklodekstrin kullanılarak bir murin makrofaj hücre hattından kolesterolün tükenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonraki kolesterol tükenmesi, ince tabaka kromatografisi ve ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak doğrulanır ve ölçülür.

Daha sonra kripto caucus neoformans hücreleri, cryptococcus kapsülünün gluc, xlo manin veya GXMA bileşenine özgü antikorlarla iyonize edilir. Son olarak, kolesterolü tükenmiş makrofajlar opsonize kripto occus neoformanlar ile enfekte edilir. Sonuç olarak, enfekte olmuş hücreleri görselleştirmek ve fagositoz derecesinin hesaplanmasına izin vermek için mücevher sürdürme ve ışık mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin temel avantajları, temel laboratuvar ekipmanlarıyla nispeten kısa bir sürede yapılabilmesi ve yine de nicel sonuçlar elde edebilmesidir. Bu yöntem, mantar patogenezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, mantar patojenlerinin optiğinde konak lipid greftlerinin rolü nedir?

Bu tekniğin anlamı, occus enfeksiyonunun tedavisine veya nuis'ine kadar uzanır, çünkü mikrofajlar içindeki içselleştirme, kritik nedenlerin başlatılması için kritik bir adımdır. Bu yöntemler mantar patojenlerinin enfektivitesi hakkında fikir verebilse de, zorunlu hücre içi patojenler gibi diğer organizmalara da uygulanabilir Steril bir biyogüvenlik kabininde tohum 10 ila beşinci, J 7 74 A 0.1 makrofaj benzeri hücreler 96 oyuklu bir kültür plakasının oyuğu başına. % 10 FBS ve% 1 penisilin, streptomisin veya PS ile desteklenmiş 200 mikrolitre DMEM'de, gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de inkübe edilir.

Ortamı hücre tek katmanından çıkarın ve hücreleri iki kez yıkamak için filtrelenmiş veya otoklavlanmış PBS kullanın. İstenilen konsantrasyonda 200 mikrolitre metil beta siklodekstrin veya embeta CD çözeltisi veya kontrol olarak bir XPBS ekleyin ve çalkalayarak 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Supernat'ı çıkarın ve piyasada bulunan bir kit ile kantitatif analiz için oda sıcaklığında saklayın.

PBS veya serum serbest DMEM ile bu prosedürün hemen ardından, kolesterol miktarını belirlemeden veya enfeksiyona devam etmeden önce hücreleri iki ila üç kez yıkayın. Kolesterolü tükenmiş makrofajları steril bir biyogüvenlik kabininde enfekte etme adımı. Tohum 10 ila beşinci makrofaj gibi hücreler kuyucuk başına.

96 oyuklu bir plakada, gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de aynı anda inkübe edin. Bir koloniyi vurulmuş bir plakadan izole ederek ve 10 mililitre YNB aşılayarak bir C neoformans H 99 kültürü büyütün, gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin ve ertesi gün çalkalayın. C neo four mans kültürünü 1, 700 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve tekrar döndürmeden önce beş mililitre bir XPBS ekleyin. Daha sonra, hücreleri bir XPBS'nin beş mililitresinde askıya almadan önce hücreleri üç kez daha yıkamak için filtrelenmiş bir XPBS kullanın. Daha sonra, yıkanmış kültürün seri bir seyreltmesini hazırlamak için, orijinal numunenin 100 mikrolitresini 900 mikrolitre bir XPBS'ye ekleyin.

Bir ila 10 seyreltme elde etmek için, bir ila 100 seyreltme elde etmek için bir ila 10 seyreltilmiş numuneden 100 mikrolitre 900 mikrolitre bir XPBS'ye ekleyin. Ve son olarak, bir ila 100 seyreltilmiş numuneden 200 mikrolitreyi 800 mikrolitre bir XPBS'ye ekleyin. Bir ila 500 seyreltme elde etmek için, bir hemo sitometreye 10 mikrolitre son seyreltme ekleyin ve makrofajları aktive etmek ve c neoformanları opsonize etmek için çalışan bir çözelti hazırlamak üzere hücre sayısını hesaplamak için sayın, her bir bileşiğin 10 mikrolitresini 990 mikrolitre PBS'de seyrelterek LPS ve interferon gamasını stok çözeltilerinden 100 kez seyreltin Her numune için 7.5 mikrolitre LPS 1.25 mikrolitre interferon gama 1.25 mikrolitre birleştirir GXM antikoru ve 1.25 kez 10 ila beşinci.

Neoforman hücrelere bakın, daha sonra FBS ve Ps ile takviye edilmiş DMEM kullanarak, hacmi numune başına 250 mikrolitreye çıkarın. Çözeltiyi girdap haline getirin ve makrofajları enfekte etmeden önce çalkalayarak 37 derecede 20 dakika inkübe edin, kolesterol tükenmesinden sonra kolesterol tükenmesi gerçekleştirilebilir. Her birine 200 mikrolitre Opsonize C neoformans çalışma solüsyonu eklemeden önce iki kez yıkamak için serumsuz DMEM kullanın.

37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Sonra hücreleri düzeltmek ve lekelemek için. Hücreleri iki kez yıkamak için DMEM kullandıktan ve hücre tek tabakasını 10 dakika havayla kuruttuktan sonra, kalan metanolü çıkarmadan önce oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin.

Daha sonra, 200 mikrolitre 10 x giza ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra iki veya üç kez yıkamak için deiyonize su kullanın, kapağı kapalı bırakın ve ertesi gün gece boyunca veya bir hafta sonra mikroskop altında kurutun. Veri noktası başına 300 hücre sayın ve enfekte makrofajların sayısını ve yutulan kriptokok hücrelerinin sayısını not edin.

Enfekte olmuş bir makrofajların yüzdesini makrofaj başına ortalama C neoforman sayısı ile çarparak PHA asidik indeksini hesaplayın. Değerleri, XPBS ile tedavi edilen kontrolün yüzdesi olarak ifade ederek F asidik indeksini normalleştirin. Birkaç denemeden sonra, F asidik indeksindeki eğilimleri belirlemek için ortalamanın ortalama değerini ve standart sapmasını hesaplayın.

Burada gösterildiği gibi anlamlılığı belirlemek için öğrencinin T-testini kullanın. Embeta CD ile tedavi edilen hücrelerden ayrılan süpernatantın analizi, PBS kontrol hücrelerinden izole edilen süpernatanıma kıyasla yüksek kolesterol ortaya çıkardı, bu da M beta CD ile tedavi edilen hücrelerde daha yüksek bir kolesterol tükenmesi seviyesine işaret etti. Tükenme, kolesterol tükenmesi sonuçlarını desteklemek için burada gösterildiği gibi süpernatan ve hücre lizatından elde edilen kolesterol değerleri kullanılarak hesaplanabilir.

TLC kullanılarak analiz edilen hücre lizatı, artan konsantrasyonlarda M beta CD sitometrisi ile tedavi edilen hücrelerde kolesterol lekelenmesinde belirgin bir azalma gösterir. TLC'nin analizi, enfeksiyon hücrelerinin yapışık ve sağlam kalmasını takiben kantitatif teste benzer bir eğilim gösterir ve görülen neoformans enfekte hücrelerde tedavi edilmemiş kontrol hücrelerine kıyasla hücre morfolojisi değişmeden kalır. Optimal olarak enfekte olmuş hücrelerin mikrografları, memeli hücreleri içinde yutulan c neoformanları açıkça göstermektedir.

Bu grafik, tedavi grubu başına 300 makrofaj hücresinden hesaplandığında, kolesterolü tükenmiş hücrelerde F asidik indeksinde bir azalma bulunduğunu göstermektedir. Bu, bu prosedürü takiben gece boyunca yapılması gereken kuluçka sürelerini içermez. Makrofajlardan deterjana dirençli membranların ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler, kolesterol tükenmesinin, konakçı lipid greftlerini etkileyerek kriptokok optiğini azaltıp azaltmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Bu teknikler ve membran biyolojisi ve immünoloji alanındaki araştırmacılar için, patojen mantarlardaki makrofaj ve patojen etkileşimleri ile fagositoz mekanizmalarını anlamanın yollarını açar. Patojenle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.