شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

الهدف من التجربة التالية هو تصور تطور الدوائر العصبية في دماغ الجنين للفأر باستخدام ثلاثة أنظمة متميزة لوسم الخلايا، وذلك عن طريق استخدام مقتفٍ عبر مشبكي ينتقل في كلا الاتجاهين، ومقتفٍ ثانٍ ينتقل في اتجاه تراجعي فقط، ووسم ثالث لا ينتقل من الخلية المستهدفة. ومن الممكن من خلال ذلك تحديد العصبون المستهدف والعصبونات السابقة له والعصبونات اللاحقة له. وتظهر النتائج أن هذا البروتوكول التجريبي يمكن استخدامه لتحليل تشكل الدوائر العصبية في دماغ جنين أنثى الفأر بدقة الخلية الواحدة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال العلوم العصبية التنموية، مثل موعد تشكل دوائر عصبية محددة وكيفية تنظيمها أثناء التطور الجنيني. كما يمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع الدوائر العصبية في الفئران البالغة. وبشكل أكثر تحديداً، يمكن توظيفها لتحليل النشاط المشبكي بين عصبونات محددة وراثياً، كما يمكن استخدامها لتحليل كيفية قيام الظروف التجريبية المختلفة بتعديل دائرة عصبية بمرور الوقت.

ابدأ باستخدام فأرة حامل تم قتلها رحيماً للتو. قم بتنظيف الجانب البطني من بطنها باستخدام 70%ethanol، ثم قم بعمل شق عمودي للكشف عن الأجنة. أخرج سلسلة الأجنة وانقلها إلى طبق يحتوي على PBS مبرد بالثلج.

قم بإزالة الأجنة الفردية باستخدام ملاقط غير حادة. افصل الأجنة الفردية في المحلول باستخدام مقص وملاقط دقيقة، مع إزالة الأنسجة الزائدة خلال هذه العملية حتى يتم تنظيف الأجنة تماماً. خذ خزعة صغيرة من ذيل كل جنين وضعها في أنبوب يحتوي على محلول منظم للتحلل (lysis buffer) لجمع الحمض النووي DNA لغرض تحديد الجنس والتنميط الجيني.

بعد ذلك، انقل الجنين إلى محلول 4% PFA مُعد حديثاً ومبرد بالثلج، مع إبقائه على الثلج. بعد معالجة كل جنين، اترك الأجنة تحضن في محلول PFA مع التقليب لمدة 1.5 hours على الأقل، وذلك حسب حجمها. وعند اكتمال فترة التحضين.

اغسل الأنسجة المثبتة ثلاث مرات باستخدام PBS بارد جداً لمدة خمس دقائق على الأقل في كل غسلة. ثم انقل الأجنة إلى محلول سكروز بنسبة 30%، محفوظ في درجة حرارة أربع درجات مئوية. وعندما تغوص الأنسجة بالكامل في المحلول، ابدأ في عملية القطع بالتجميد.

أولاً، ابدأ بتمييز قالب التجميد باستخدام قلم تخطيط دائم مقاوم للكحول. بعد ذلك، قم بتحضير ملاط من الثلج الجاف المسحوق في 100% Ethanol في دلو ثلج، واستخدم هذا الملاط لتبريد كؤوس زجاجية تحتوي على isop pentane لمدة 10 دقائق تقريباً. وأثناء الانتظار، أخرج الأنسجة من محلول السكروز وامسح السكروز الزائد باستخدام منديل مختبري قياسي.

بعد ذلك، انقل النسيج إلى قالب تجميد مُصنف مسبقاً، مع إضافة كمية كافية من مركب OCT لتغطية النسيج. تجنب تشكيل أي فقاعات هوائية في مركب OCT، خاصة حول النسيج.

بعد ذلك، يتم توجيه النسيج باستخدام ملقط حشري رقيق الوزن لضمان حدوث أدنى قدر من الضرر. يتم تجميد قوالب التجميد في حمام iso pentane المبرد دون التسبب في أي تطاير للسائل إذا لزم الأمر. ويمكن تغليف القوالب المجمدة وتخزينها عند درجة حرارة -80 °C من أجل تقطيع القوالب.

قم بتقطيعها إلى مقاطع متسلسلة بسمك 14 micron في مجموعات مكونة من خمس شرائح. اجمع كل مجموعة من خمس شرائح على شريحة زجاجية من نوع super frost plus. عند تحضير المحلول لهذا البروتوكول، تأكد من إضافة tween 20 ببطء إلى منظم TNT buffer، والذي يجب تحضيره طازجاً.

بعد ذلك، قم بدفع المحلول للأعلى والأسفل ببطء للمزج. وعند تحضير منظم TNB، أضف كاشف الحجب ببطء على دفعات صغيرة مع التحريك. ثم قم بتسخين المحلول إلى 55 °C باستخدام حمام مائي.

سيصبح المحلول عكراً. والآن، لبدء العمل على الأنسجة، استخدم أولاً مشرطاً لإزالة مادة OCT الزائدة المحيطة بمقاطع الأنسجة. ثم حدد حدود كل مقطع باستخدام قلم pap.

اترك الشرائح حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسلها في محلول منظم XPBS بدرجة حرارة الغرفة ثلاث مرات، بحيث تستغرق كل غسلة خمس دقائق. تالياً، قم بتثبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي عن طريق تحضين الشرائح لمدة نصف ساعة في محلول بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 0.3% في الميثانول المبرد بالثلج.

يتبع ذلك إجراء ثلاث غسلات بمحلول PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسلة. ثم تُحضن الشرائح لمدة 10 دقائق في محلول PBST لنفاذ الأنسجة. وفي هذه المرة، تُغسل الشرائح ثلاث مرات بمحلول TNT.

الآن في غرفة رطبة، قم بحجب النسيج في كمية كافية من محلول TNB لتغطية كل شريحة. اترك عملية الحجب تستمر لمدة نصف ساعة في درجة حرارة الغرفة. لا تسمح للشرائح بأن تجف.

بعد تفريغ محلول الحجب تماماً، غطِّ الشريحة بالمضاد الأولي في TNB لربط الكاشف. يتم التحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT) أو طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. ولإزالة المضاد الأولي، اغسل الشريحة بمحلول TNT ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

خلال عمليات الغسل هذه، استخدم رجاً خفيفاً. بعد ذلك، قم بحضن المقاطع في محلول الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة. وفي وقت لاحق، وفي درجة حرارة الغرفة، استخدم ثلاث عمليات غسل بمحلول TNT لإزالة الجسم المضاد الثانوي غير المرتبط.

بعد ذلك، وفي غرفة رطبة، يتم تحضين الأنسجة في محلول TNB يحتوي على 1:100 من havein المجرد والمقترن بـ horse radish peroxidase لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع غسل الشرائح في محلول TNT. بعد التحضين، يتم تحضير تخفيف جديد من محلول TSA. ثم يُوضع تخفيف TSA المُحضَّر حديثاً على الأنسجة لمدة 10 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة.

يعتبر التوقيت الدقيق لحضن TSA أمراً بالغ الأهمية. لذا، لا تحاول معالجة عدد كبير جداً من الشرائح في وقت واحد يدوياً. يمكن التعامل مع ما يصل إلى 10 شرائح في الخطوة الواحدة.

يمكن أن تظل الشرائح الإضافية في محلول غسيل TNT حتى يتم معالجتها بعد جولة أخرى من عمليات الغسيل. قم بتحضين الأنسجة مع Alexa Fluor 546 streptavidin conjugate في محلول TNB لمدة 30 دقيقة.

في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة مرافق habitant المجرد بثلاث حمامات أخرى من TNT. بعد ذلك، ولصبغ النوى، ضع محلول benza بتركيز 5%BIS في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ثم قم بإزالة صبغة BIS benzo بثلاث غسلات TNT. بعد ذلك، قم بتثبيت الشرائح باستخدام fluoro Mount G وابدأ في تحليلها.

باستخدام البروتوكول الموصوف، تم تحليل نضج الدوائر العصبية التي تنظم المحور التناسلي في الفئران التي تحمل الأليلات R 26 BIZ و R 26 GTT. تم تنشيط تعبير الجينات المنقولة عن طريق إعادة التركيب المعتمدة على creed في عصبونات kisspeptin الجنينية في النواة القوسية باستخدام خط creed محفز خاص بـ Kisspeptin، مع استخدام التألق المناعي المزدوج لـ kisspeptin باللون الأخضر و BL باللون الأحمر من kiss. IC R 26 BIZ.

يظهر الفأر تنشيط BL في KISS IC R 26 GTT؛ حيث يظهر الفحص المناعي المزدوج الفلوري KISSPEPTIN باللون الأخضر و GTT المنشط بواسطة Cree driver باللون الأحمر. وقد أثبتت هذه الاختبارات التشخيصية وغيرها أن الجينات المنقولة كانت وظيفية في الأجنة التجريبية في المرحلة E 18.5. ووُجد أن عصبونات His pepin في النواة القوسية تتواصل بالفعل مع GNRH.

كان نقص Z مقتصرًا على عصبونات kisspeptin التي تعبر عن CRE، بينما انتقل BL عبر المشابك العصبية إلى العصبونات الموجودة في المنبع والمصب. احتوت بعض عصبونات GNRH، وليس جميعها، على bl.

وبالتالي، فإن مجموعة فرعية فقط من عصبونات GNRH الجنينية تتصل تشابكياً بعصبونات kisspeptin في النواة القوسية. لم تحتوي عصبونات GNRH على المقتفي الارتجاعي. يوضح GTT أن هذه العصبونات تقع في مرحلة لاحقة (downstream) من عصبونات kisspeptin.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في يوم واحد باتباع هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى مثل التألق المناعي المزدوج لتحديد الطبيعة الكيميائية الحيوية للعصبونات المتصلة. ومن شأن هذه التقنية أن تمهد الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية والبيولوجيا التنموية لاستكشاف الاتصال العصبي بدقة الخلية الواحدة، سواء أثناء التطور أو في الحيوانات البالغة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تشكل ونضج الدوائر العصبية في الفئران.