بروتوكولات الحصول اقحي والجسدية الأجنة لدراسة تنظيم تطور الجنين في وقت مبكر من البقول نموذج

الهدف العام من الإجراءات التالية هو توضيح عدد أجنّة tula المحملة التي يمكن الحصول عليها في مراحل نمو مختلفة لدراسة التنظيم الجيني لتكوّن الأجنّة في النباتات، ويمكن تحقيق ذلك من خلال ربط مورفولوجيا القرون مع مراحل نمو الجنين الزيجوتي المختلفة، وعن طريق زراعة قطع تفسيرية من الأوراق للحصول على أجنّة جسدية في المراحل المختلفة. وفي النهاية، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (quantitative PCR) وإنزيم بيتا جلوكورونيداز (beta glucuronidase) لتقييم تعبير الجينات أثناء تكوّن الأجنّة في مراحل نمو محددة تكون محل اهتمام. وتتمثل مزايا هذه التقنيات في عدم الحاجة إلى تمييز الأزهار الفردية في التجارب الحية (in vivo)، كما توفر الإجراءات المحسّنة في المختبر (in vitro) مناهج تجريبية تكميلية.

يعتبر العرض المرئي لإجراءات الزراعة أمراً هاماً لأنه يتيح متابعة تفاصيل المعالجات بدقة أكبر. وسيقوم ing Wang بشرح الإجراء في الجسم الحي (in vivo)، بينما ستقوم Kim Nolan بشرح الإجراء في المختبر (in vitro). ولتسهيل نمو الأجنة الزيجوتية، قم بثقب سطح غلاف البذور لبذور من نبات Monte cargo trinocular ونقع البذور طوال الليل، بحيث تكون مغطاة بالكامل بالماء.

في اليوم التالي، ازرع ثلاث بذور في كل وعاء من 10 أوعية بقطر 15 سنتيمتر باستخدام خليط التربة، ثم انقل الأوعية إلى دفيئة زجاجية. قم بزراعة النباتات تحت فترة إضاءة تستمر 14 ساعة مع درجة حرارة نهارية وليلية تتراوح بين 23 إلى 19 درجة Celsius، مع الاحتفاظ بأكثر الشتلات صحة بعد الإنبات بحيث يكون هناك نبات واحد لكل وعاء، وإحاطة الشتلات بتعريشة لتتسلق عليها سيقان النباتات عند ظهور القرون. اجمع العينات في المراحل المناسبة الموضحة في الجدول 1 والشكل 1 للحصول على مرحلة تطور الجنين المبكر المطلوبة.

بعد ذلك، استخدم الملقط لعزل الأجنة من القرون. وبدلاً من ذلك، وللحصول على صور مجهرية أكثر دقة، يمكن إجراء عملية ترويق كاملة باستخدام محلول Hoyer، حيث يمكن تأكيد مراحل الجنين عن طريق تصوير الأجنة تحت مجهر مركب قياسي. ثم اجمع عدد الـ UL المطلوب للتجربة من المنطقة المركزية للقرن، وقم بتخزينها في درجة الحرارة المناسبة للتحليلات اللاحقة الخاصة بتطور الأجنة الجسدية.

قم بحصاد الكساءات الورقية مختبرياً من أحدث ورقة تاتية (tate leaf) متمددة بالكامل تقريباً من ساق متطاولة لصنف من نبات tran atula قادر على تكوين أجنة بسهولة في المزرعة. احتفظ بالأوراق التاتية على مناشف ورقية رطبة في وعاء زراعة لتجنب الجفاف. بعد ذلك، وأثناء العمل داخل كابينة سلامة بيولوجية معقمة بالأشعة فوق البنفسجية، ضع الأوراق داخل الكرة الشبكية لمنقوع شاي قابل للتعقيم بالأتوكلاف.

غمر أداة التلقيح في 70%Ethanol داخل وعاء أوتوكلاف سعة 250 milliliter بغطاء لولبي. وعاء استنبات من البوليكربونات بعد 30 ثانية، يتم تصفية أنسجة الأوراق ثم غمر أداة التلقيح في محلول مبيض مخفف بنسبة واحد إلى ثمانية لمدة 10 دقائق. مع التدوير اللطيف من حين لآخر، يتم تدوير الوعاء بلطف وتصريف المياه الزائدة.

بعد ذلك، قم بشطف مصفاة النقع. مرة أخرى في ماء منزوع الأيونات جديد في وعاء جديد. الآن استخدم ملقطاً معقماً لنقل الأوراق من مصفاة النقع إلى مستنبت جديد، وهو وعاء يحتوي على ماء مقطر منزوع الأيونات ومعقم، ثم أحكم إغلاق الغطاء المعقم.

بعد ذلك، اشطف الأوراق عن طريق قلبها وتحريكها بشكل دائري. ثم اترك الوريقات تطفو على الماء المعقم لتجهيز الغرسات للزراعة في الأطباق. قم بقص حواف الوريقات المعقمة كل واحدة على حدة باستخدام تقنية تعقيمية.

ثم قم بتقطيع المستطيل المتبقي إلى مستطيلين أو ثلاثة، بأبعاد تتراوح من 8 إلى 10 مم في 3 إلى 5 مم، بحيث يكون العرق الوسطي في مركز كل قطعة من المستقطعات. ضع ست مستقطعات في كل طبق بتري بقطر 9 سم يحتوي على وسط استزراع آغار صلب، مع جعل جانب الـ ABA للأسفل للحفاظ على التوجه المعتاد للورقة.

بعد ذلك، يتم إغلاق أطباق بتري باستخدام فيلم البرافيل، وتُحضن الأطباق في الظلام عند 28 درجة Celsius في غرفة ذات درجة حرارة مضبوطة. وبعد ثلاثة أسابيع، تُستخدم ملعقة وملاقط معقمة من الفولاذ المقاوم للصدأ لنقل المستنبتات الثقابية المتمايزة إلى وسط غذائي جديد. ومن المفترض ملاحظة الأجنة الأولى في غضون أربعة أسابيع تقريبًا مع حدوث تكوين الكالوس، وبمجرد أن يتجاوز الكالوس حجم أكبر مستنبت معروض هنا.

انقل 50% فقط من الكالوس الفردي عند إجراء الاستزراع الفرعي في وسط غذائي جديد. وأخيرًا، استخدم مجهر ستيريو لجمع مراحل الأجنة المختلفة خلال فترة حضانة تتراوح من أربعة إلى ثمانية أسابيع، مع معالجة المستأصلات وفقًا للأهداف التجريبية. بعد حصاد الأجنة الزيجوتية كما تم توضيحه، يمكن استخدام التهجين في C2 أو استراتيجيات أخرى مناسبة؛ وكما يظهر في هذه الصور، يمكن ملاحظة التمايز بين SSIS و Spencer من خلال تتبع المستأصلات المزروعة.

خلال الأسابيع من الرابع إلى الثامن، يمكن تحديد ومسح الأجنة الجسدية في مراحل مختلفة من أجل تحليلها فوراً. على سبيل المثال، توضح هذه البيانات كيف تظهر الأجنة في مرحلة Olein المبكرة تعبير نوع واحد من جينات medicago Tula eoin، بينما لا تظهر تعبير نوع آخر. ومن المزايا الخاصة بنظام الجنين الجسدي إمكانية إجراء تحويل الكالوس دون الحاجة إلى تجديد نبات كامل.

بالفعل، كما تم توضيحه هنا. يمكن استخدام Beta glucuronidase لتصور التعبير الجيني في مراحل مختلفة من التخلق الجنيني. بعد مشاهدة الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختيار وتشريح القرون للحصول على النتائج.

يجب أن يكون لديك أيضاً فهم جيد لكيفية تحضير وزراعة الأجزاء النباتية (explants) المعقمة من أجل تكوين الأجنة الجسمية بعد نموها. لقد مكنت هذه التقنيات من استقصاء تنظيم النسخ في المراحل المبكرة من تكوين الأجنة فيما يتعلق بنمو الجنين وتطوره وتخزين العناصر الغذائية.