הדמיה זקופה של דרוזופילה לשכות ביצה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של הקטבים של תאי ביצים של דרוזופילה. זה מושג על ידי ניתוח תחילה של הביצית וצביעתן בנוגדנים פלואורסצנטיים. השלב השני הוא זיהוי והפרדה של תאי ביצים מעניינים.

לאחר מכן, הדגימות שנבחרו מכוונות ומיושרות, ולאחר מכן מוטמעות בגושי ג'לי גליצרין. השלב האחרון הוא לחתוך ולסובב בלוקים כדי להרכיב תאי ביצים כך שהציר הארוך יהיה אנכי. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה קונפוקלית משמשת לחשיפת ארגון תאי ותת-תאי בקטבים של תא הביצים.

אפיתל, כגון סידורי תאי גבול, שיטות קיימות לצפייה בדגימות בניצב למישור ההדמיה באמצעות חתך אופטי ושחזור תלת מימד אלגוריתמי עלולות לגרום להלבנת אור ופיזור אור ולספק רזולוציה גרועה יותר, מה שמניב תמונות פחות מדויקות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לנו להרכיב דגימות בזווית חדשה ולצפות בהן ישירות. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לדמות את הקטבים של תאי ביציות מתפתחים, שסיפקו תובנה לגבי ארגון תאי הזקיק.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את שלבי ההכנה וההרכבה מכיוון שהם דורשים מיקרומניפולציה של דגימות כתמים וכיוון מחדש של הדגימות מנקודות המבט הקונבנציונליות. מי שתדגים את ההליך תהיה לאייש את Lathea סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי. כדי להתחיל בניסוי, השיגו שקופית שקע זכוכית והשליכו כמה טיפות של אמצעי חיתוך לכל חלל.

הרדמו את הזבובים בפחמן דו חמצני והניחו אותם תחת מיקרוסקופ דיסקציה. לאחר מכן, כוונו נקבת זבוב אחת עם הכנפיים כלפי מטה והראש לכיוון שמאל. החזק את המלקחיים בכל יד בזווית של 30 מעלות למשטח השולחן עם היד הלא דומיננטית.

הרם את הזבוב באמצעות מלקחיים. אחוז בזבוב בחלק הקדמי של הבטן ליד בית החזה וטבל אותו באמצעי הדיסקציה. בשקע החלק עם זוג המלקחיים השני.

אחוז בשלד החיצוני בחלק האחורי הגחוני של הבטן ונקב דרכו. תפוס את השחלות בקצה האחורי, ואז משוך אותן מהבטן והנח אותן לתוך המדיה הטרייה בצד השני של מגלשת השקע. לאחר מכן החזיקו שחלה בקצה האחורי ליד תאי הביצים הגדולים ביותר, וביד השנייה, צבטו את אחד מתאי הביצים הקדמיים ביותר או ג'אמר לאט ובהתמדה.

משוך שרשרת אוביאלית ממעטפת השחלה והמשיך לנתח את הביצית בנפרד עד להסרת כל תאי הביציות הרצויים. לאחר השלמת הדיסקציה, השתמש בפיפטה העברה מפלסטיק כדי להעביר את האליפסה לצינור של 0.6 מיליליטר ולתת לביצית להתיישב לתחתית הצינור. בעזרת פיפטה הסר בזהירות כמה שיותר מאמצעי החיתוך מהביציה.

היזהר לא להסיר תאי ביצים או ביצים בצינור חדש. הוסף 50 מיקרוליטר של 16% פרה-פורמלדהיד ל-150 מיקרוליטר של 0.1 מולארי אשלגן פוספט, והוסף את זה לתאי הביצים. דגרו אותם תוך כדי נדנדה במשך 10 דקות לאחר הדגירה, הסר את הקיבוע.

יש לשטוף פעמיים עם מאגר NP 40, ולאחר מכן לשטוף על האנטנות פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מאגר NP 40 למשך 15 דקות כל אחת בטמפרטורת החדר. לאחר קיבוע ושטיפה יש להוסיף נוגדנים ראשוניים ולדגור את הביצית למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או שלוש שעות בטמפרטורת החדר לאחר הדגירה. שוטפים את הדגימות ארבע פעמים למשך 20 דקות כל אחת עם 0.5 מיליליטר של מאגר NP 40 בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הוסיפו נוגדנים משניים בדילול של 1 עד 200 ודגרו על הביצית למשך שלוש שעות או לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף DPI בדילול של 1 עד 1000 ודגר את הביצית למשך 10 דקות. לאחר מכן שטפו את הדגימות ארבע פעמים עם 0.5 מיליליטר של מאגר כביסה NP 40 למשך 20 דקות לכל שטיפה בטמפרטורת החדר.

לאחר השלמת פרוטוקול האימונופלואורסצנציה או IF, הוסף 200 מיקרוליטר של 50% גליצרול ב-PBS לתאי הביצים ותן להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים מוגנים מאור. הסר את התמיסה, ואז החלף אותה ב-70% גליצרול ב-PBS וכסה את הצינור בנייר כסף. אחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות להרכבה.

להכנת ג'לי הגליצרין, החליקו את ג'לי הגליצרין עם מרית למילוי צינור תרבית זכוכית פיירקס בנפח 15 מיליליטר בערך במחצית הדרך, המיסו את ג'לי הגליצרין באמבט מים בחום של 55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בינתיים, הניחו טיפה של 300 מיקרוליטר גליצרול מתמיסת המלאי על שתי שקופיות מיקרוסקופ. בעזרת טישו מורחים את הגליצרול בשכבה דקה על פני כל אחת מהשקופיות.

לספק בסיס המאפשר הסרה קלה של ג'לי גליצרין. בדוק שג'לי הגליצרין נמס היטב. לאחר מכן, חתכו את הקצה של קצה פיפטה מסונן של 1000 מיקרוליטר והעבירו לאט לאט 1000 עד 1,500 מיקרוליטר של ג'לי גליצרין חם לכל שקופית מיקרוסקופ תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות.

הניחו למגלשות ג'לי הגליצרין לשבת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבע תחרה של כל ג'לי גליצרין. החלק פנימה צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר על 15 מילימטר. מכסים את הכלי בניילון נצמד ומאחסנים את השקופיות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

פיפטה כמה טיפות מיקרוליטר של תאי ביצים מהדגימות שהוכנו בעבר ב-70% גליצרול על פני שקופית ג'לי גליצרין אחת. המשיכו לזרוק שלוש טיפות מיקרוליטר עד שכל תאי הביצים נמצאים על המגלשה, וודאו שכל טיפה מכילה לפחות 10 תאי ביצים. לאחר מכן, חממו לתרבית צינור של ג'לי גליצרין באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס, הניחו שקופית ג'לי גליצרין עם תאי ביצים מתחת למיקרוסקופ דיסקציה והתאימו הגדלה כך שרק טיפה אחת של תאי ביצים תהיה בשדה הראייה.

בעזרת מחט בגודל 30 כף, הרם את תא הביצים הרצוי בעת הצורך. הפרד את תאי הביצים הרצויים משרשרת אוביאלית באמצעות המחט כסכין כדי למנוע פסולת שעלולה להפריע להדמיה. העבירו את תא הביצים לשקופית ג'לי הגליצרין השנייה.

חזור על שלב זה עד שיהיו לפחות שבעה תאי ביצים מסודרים בטור כשהצדדים הקדמיים פונים שמאלה. מגרדים פסולת או תאי ביצים לא רצויים בעזרת המחט, יוצרים עמודות חדשות של שבעה עד שכל תאי הביצים הרצויים מועברים לשקופית הג'לי השנייה, סובבו חתיכה קטנה של מגבון קים, ואז ספגו את עודפי הגליצרול PBS מתאי הביצים על ידי נגיעה קלה בכל אחד מהם. הקפד לא להסיר תאי ביצים.

חותכים את קצה הפיפטה של פילטר 200 מיקרוליטר ומעבירים 150 מיקרוליטר ג'לי גליצרין כדי לכסות את כל עמודי תאי הביצים. ודא במיקרוסקופ שכל עמודי תא הביצים מכוסים. הניחו לתאי הביצים המותקנים לשבת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עד שהשכבה העליונה של ג'לי הגליצרין התמצקה לחלוטין.

לאחר מכן הניחו שקופית של תאי ביצים רכובים בצלחת פטרי בגודל 60 מילימטר על 15 מילימטר וכסו אותה בניילון. אחסן את המנה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לשכבות ג'לי הגליצרין להתמצק יחד בחושך. אם פוטוהלבנה עלולה להתרחש, הנח שקופית של תאי הביצים המותקנים מתחת למיקרוסקופ דיסקציה.

התאם הגדלה כך שרק עמודה אחת של תאי ביצים תהיה בשדה הראייה. שימוש באזמל מיניאטורי בזווית של 45 מעלות. חותכים קו ישר לאורך הצד הימני של העמודה הראשונה של תאי הביצים קרוב לצד האחורי של תאי הביצים.

לאחר מכן, חותכים מעל תא הביצים הראשון בחלקו העליון ומתחת לתא הביצים האחרון בעמודה כך שתאי הביצים נחתכים כעת משלושה צדדים. השתמש בסכין מיקרו כדי לפרוס לאורך הצד השמאלי של העמוד קרוב ככל האפשר לצד הקדמי של תאי הביצים. ואז פיפטה 100 מיקרוליטר של קור אחד XPBT מעל העמוד החתוך עם סיבוב והמרית שלו.

הסר את עודפי ג'לי הגליצרין סביב שלושת צידי העמוד החתוך של תאי הביצים והשליך את העודפים. הכנס את המרית לחיתוך שנעשה בצד הקדמי של תאי הביצים והפרד את העמוד מגוש ג'לי הגליצרין הראשוני כדי לעלות על שקופית ולהמשיך בהדמיה. שיטת ההדמיה הזקופה מאפשרת הדמיה ישירה של ארגון התאים באפיתל הזקיקי הקדמי בשלב שמונה.

סמן כללי לזקיק גופרתי, העיניים נעדרות או חלבון IA, כמו גם סמן ה-DNA הגרעיני DPI מראים ביטוי אחיד על פני שדה תאים זה ומדגימים שניתן לראות את כל התאים בעוצמות צביעה דומות. התצוגה המקובלת של תא ביצים מנוגדת לתצוגה שנוצרה על ידי שחזור תלת מימדי של תא הביצים. הכניסה מציגה את הציר המסובב.

ציר ה-x למטה. ציר Z נמצא כעת לכיוון שמאל, וציר Y לכיוון הצופה. תאים בודדים מטושטשים עקב רזולוציה נמוכה בציר Z.

לפיכך, הגישה החדשה מייצגת שיפור משמעותי בהדמיה. שיטת ההדמיה הזקופה מדמיינת ביעילות את האפיתל הקדמי בתאי ביצים בשלב תשע. בשלב התפתחותי זה, תאי הגבול מתלכדים יחד סביב תאי הקוטב.

אשכולות דחוסים אלה נצפים בהדמיית האנדון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להרכיב דוגמאות כדי לאפשר פרספקטיבות צפייה חדשות. השתמשנו בטכניקה זו כדי לדמות את הקטבים של תאי ביצים מתפתחים בשלבים נבחרים.

טכניקה כללית זו יכולה לשמש לשלבים אחרים של דרוזופילה, אוגנזה או לסוגים אחרים של רקמות קטנות.