Trasformazione Biolistic di una fluorescente Tagged Gene nel Opportunistic Fungal patogeni Cryptococcus neoformans

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire una dimostrazione passo dopo passo della trasformazione biotica di un costrutto lineare che contiene un tag fluorescente. Ciò si ottiene rivestendo prima le perline d'oro delle microcar con il DNA di interesse. Nella seconda fase, il DNA viene trasferito alle cellule C neo forine mediante pistola genica.

Le cellule trasformate vengono quindi piastrate e l'integrazione del costrutto di DNA viene valutata mediante PCR e R-T-P-C-R. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per confermare la corretta integrazione del prodotto di DNA tramite ricombinazione omologa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettroporazione, è che la trasformazione BIC si traduce in un'integrazione stabile nel genoma dell'ufficio crittografico.

Prestazioni quasi. A dimostrare questa tecnica è Tanya Taylor, una dottoranda del mio laboratorio che è diventata esperta in questa tecnica. Iniziare utilizzando una pinza per immergere i dischi BIC macro carrier arancioni in etanolo al 100%, quindi trasferire i dischi in una grande capsula di Petri contenente essiccatore, facendo attenzione che i dischi non tocchino l'essiccante.

Una volta asciutti, premere i dischi in supporti per dischi d'argento puliti con etanolo, quindi vorticare un tubo di perline d'oro e aliquotare 12 microlitri della soluzione di perline in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri per trasformazione. Successivamente, in sequenza, aggiungere due microgrammi di DNA, 10 microlitri di cloruro di calcio e due microlitri di spermatozoi a base libera in ogni tubo di perline. Vortice ogni campione.

Quindi incubare le provette a temperatura ambiente per cinque minuti con un leggero movimento occasionale per risus. Sospendere le perle depositate alla fine della pallina di incubazione le perle d'oro rivestite di DNA e aspirare con cura lo snat. Risospendere lentamente le perle completamente in 600 microlitri di etanolo al 100%, quindi pellettare nuovamente le cellule.

Questa volta sospendendo le perle in otto microlitri di etanolo. Ora erogare ogni tubo di perline al centro di un singolo disco BIC in cerchi di un centimetro di diametro. Se è presente una concentrazione sufficiente di perline, un cerchio d'oro sarà visibile al centro di ogni disco.

Una volta che le perle sono asciutte, per azionare la pistola genetica, accendere prima la pompa del vuoto, quindi ruotare la manopola del serbatoio dell'elio in senso antiorario fino a raggiungere una pressione di circa 2200 PSI sul manometro. Quindi, capovolgi l'interruttore rosso sinistro per accendere la pistola genetica e regolare le portate per il vuoto e lo sfiato in modo che il vuoto raggiunga 28 pollici di mercurio entro 15 secondi. Verificare che la distanza tra il disco di rottura e il portatore macro sia di circa tre ottavi di pollice in questo momento.

Quando tutto è in posizione, pulire l'intera camera con etanolo al 70% e immergere i dischi di rottura in etanolo al 100%. Dopo aver asciugato i dischi su una superficie sterile, utilizzare una chiave dinamometrica per allentare il supporto del disco di rottura e inserire un disco pulito. Riavvitare il supporto del disco di rottura in posizione e ruotarlo una volta verso destra con la chiave dinamometrica per serrarlo.

Quindi immergere gli schermi a rete in etanolo al 100%. Una volta asciutto, posizionare uno schermo sulla piastra di montaggio in plastica bianca e posizionare il supporto del disco macro con il lato DNA rivolto verso il basso nella camera del disco, avvitare il tappo argentato e posizionare la piastra di montaggio nella fessura più alta. Quindi posizionare una piastra a coclea YPD contenente un molare di sorbitolo sulla piastra inferiore.

Ora chiudi lo sportello della camera e bloccalo in posizione. Quindi premere e tenere premuto l'interruttore rosso centrale in posizione sollevata per attivare l'aspirapolvere e consentirgli di raggiungere i 28 pollici di mercurio. Una volta raggiunto il livello di vuoto corretto e l'interruttore centrale è stato spostato in posizione abbassata, tenere premuto l'interruttore rosso destro per sparare.

Quando il disco di rottura si apre, rilasciare immediatamente il pulsante di fuoco e spingere l'interruttore rosso centrale in posizione centrale. Per sfiatare la camera a zero PSI se il colpo è andato a buon fine, sulla piastra sarà visibile un anello d'oro. Pulisci il disco di rottura e i detriti del disco portatore macro e spegni la pistola genetica.

Quindi ruotare la manopola del serbatoio dell'elio in senso orario per spegnere il gas e spegnere la pompa del vuoto. Dopo un periodo di riposo di quattro ore, aggiungere 700 microlitri di YPD a ciascuna piastra. Quindi utilizzare un raschietto cellulare per sollevare delicatamente le cellule dalla coclea e trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Dopo un secondo lavaggio YPD per recuperare tutte le cellule, farle girare verso il basso e risospendere il pellet. In 500 microlitri di YPD, quindi erogare 100 microlitri di sospensione cellulare al centro di YPD più piastre antibiotiche e stendere le cellule con perle di vetro. Infine, incubare le piastre a testa in giù a temperatura ambiente per tre o quattro giorni.

Man mano che compaiono le colonie, applicare un cerotto su nuove piastre YPD e antibiotiche. Sia il DNA che l'RNA possono essere isolati dalle singole colonie di neoformanti e analizzati per confermare una corretta integrazione ed espressione dei costrutti. Ad esempio, se questo protocollo viene utilizzato per il tag, la PCR di fusione genica verrebbe condotta utilizzando un set di primer in cui un primer e neos all'esterno del costrutto e all'interno del genoma circostante per confermare la corretta ricombinazione nel locus desiderato.

Le corsie uno e due sono prodotti PCR ottenuti. Utilizzando questo set di primer con DNA genomico di neoformans selvatici di tipo C H 99 e il ceppo trasformato di ciliegia A CKM, R-T-P-C-R verrebbe quindi utilizzato per confermare che sia il gene di interesse che il tag sono espressi. Infatti. Questo prodotto di fusione R-T-P-C-R indica che il tag è stato correttamente fuso al gene a livello di RNA.

La microscopia a fluorescenza può quindi essere utilizzata per confermare che la ricombinazione nel locus desiderato ha avuto successo e che l'RNA è stato tradotto nella proteina di interesse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare una pistola Balistic Jing e usarla per un'integrazione omologa di successo di un costrutto lineare nel genoma del criptococco. Neo formm.