Name: Isolamento de células mononucleares do Sistema Nervoso Central de ratos com EAE (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:23:00.000+00:00
Duration: 20 min 51 s
Description: Aprenda a isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos com EAE usando perfusão cardíaca e gradiente de Percoll. Este método remove sangue contaminante e fornece células viáveis para citometria de fluxo e cultura celular.

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<ol><li> Profundamente anestesiar ratos. Pulverização com etanol 70% e fazer uma perfusão cardíaca com PBS por 10 min para remover as células dos vasos sanguíneos (corte os átrios direito e perfundir através do ventrículo esquerdo). </li><li> Remover o cérebro ea medula espinhal e coloque em um tubo de 50 ml contendo gelada PBS. Cortar o cérebro ea medula espinhal em um coador de células 70 milímetros colocado em um prato de 10 centímetros de petri contendo 10 ml de PBS gelado. Pressione cada pedaço de órgão através do filtro de células usando as costas de um êmbolo da seringa estéril 1 ml. Recolher a suspensão única célula em um tubo de 50 ml no gelo. Lavar o filtro de células com PBS e adicionar ao tubo até que a solução é clara. </li><li> Centrifugar por 80-10 min a 390 g. </li><li> Ressuspender as células em 20 ml Percoll PBS + 30% e sobreposição em 10 ml de PBS Percoll + 70%. </li><li> Centrifugar a 390 g por 20 min em temperatura ambiente. </li><li> Retire a gordura na parte superior do tubo. Coletar as células a partir da interface e lavar duas vezes com PBS. Count. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+clinical+scoring+of+chronic-relapsing+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.</li>
</ol>

Este procedimento, como todos os procedimentos envolvendo animais vivos, deve ser aprovada pelo uso de sua instituição animal e comissão de cuidado. Recomendamos que um veterinário ou um técnico veterinário estar presente ao executar o primeiro perfusões cardíaca para garantir um nível suficiente de anestesia é dada ao animal antes e durante o procedimento, e que os animais não sofrem dores ou aflições desnecessárias.

<table><tbody><tr><td>PBS, 1x, estéril</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Filtro celular, 70 µm</td><td>Ferramenta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de células mononucleares do sistema nervoso central de ratos com eae

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

Se estudar uma doença auto-imune direcionada para o sistema nervoso central (SNC), tais como encefalomielite autoimune experimental (EAE, 1), ou a resposta imunológica a uma infecção do SNC, tais como poliomielite, neuroborreliose Lyme, ou a neurossífilis, é muitas vezes necessário isolar as células do SNC infiltrantes imunológico. Neste vídeo protocolo demonstramos como isolar células mononucleares (MNCs) a partir do SNC de um rato com EAE. O primeiro passo deste procedimento requer uma perfusão cardíaca dos roedores com uma solução salina para assegurar que nenhum sangue permanece nos vasos sanguíneos que nutrem o SNC. Qualquer contaminação do sangue vai aumentar artificialmente o número de aparente CNS-infiltrando multinacionais e pode alterar a composição aparente do sistema imunológico se infiltrar. Nós, então, demonstrar como remover o cérebro ea medula espinhal do rato para dilaceração subseqüentes para preparar uma suspensão de uma única célula. Esta suspensão é separado em um gradiente de Percoll duas camadas para isolar as multinacionais. Após a lavagem, estas células são, então, pronto para passar por qualquer procedimento necessário. Células mononucleares isoladas usando este procedimento é viável e pode ser usado para eletrofisiologia, citometria de fluxo (FACS), ou bioquímica. Se a técnica é realizada sob condições estéreis (utilizando instrumentos esterilizados em uma capa de cultura de tecidos) as células podem também ser cultivadas em meio de cultura de tecidos. A população de determinada célula pode ser purificado usando procedimentos de separação magnética ou um FACS.

Neste vídeo demonstramos como isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos com encefalomielite autoimune experimental.

Isolamento de células mononucleares do Sistema Nervoso Central de ratos com EAE

Seja estudando uma doença autoimune direcionada ao sistema nervoso central (SNC), como a encefalomielite autoimune experimental (EAE, 1), ou a ...

Ok. Olá, sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E hoje vou mostrar como isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos.Portanto, este procedimento envolve anestesiar profundamente um rato para realizar uma perfusão cardíaca, de modo que não tenhamos nenhum sangue contaminante no sistema nervoso central. Quando o retirarmos, então extrairemos o cérebro e a medula espinhal, faremos uma suspensão de células únicas usando um filtro celular e, em seguida, utilizando um gradiente de dupla camada de percol, isolaremos as células mononucleares. Vamos começar.Agora estou pronto para realizar a perfusão cardíaca, então vou mostrar todos os materiais de que preciso para isso. A primeira coisa de que precisamos é de um frasco de Bel, e aqui embaixo colocamos toalhas de papel embebidas com anestésico volátil. Você pode usar halano ou isoflurano.A seguir, precisamos de algo para segurar o rato e de algo para coletar o sangue. Assim, temos esta instalação improvisada para perfundir os ratos. Você vai usar uma agulha de 21 gauge e vamos perfundir uma soluçã

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Research

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Biologia

O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.

Isolamento do Cérebro e da Medula Espinhal Células Mononucleares Usando Percoll Gradients

Neste vídeo, realizamos o isolamento de células mononucleares do cérebro de um camundongo usando centrifugação por gradiente de densidade. A suspensão isolada de células mononucleares pode ser usada para análises posteriores a jusante.

Isolamento de células mononucleares do cérebro de camundongos: uma técnica de centrifugação por gradiente de densidade para isolar células mononucleares residentes no cérebro

Este vídeo demonstra o processo de isolamento de microvasos cerebrais de ratos sacrificados. Inclui a dissecção do cérebro, limpeza do tecido e digestão mecânica, seguida de centrifugação repetida para isolar a fração pura dos microvasos.

Um método para o isolamento de unidades neurovasculares do cérebro de ratos

Este manuscrito descreve os métodos de indução e pontuação do modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE), juntamente com a avaliação da distribuição de células imunes e níveis de citocinas de mRNA em linfonodos, baço, sangue e medula espinhal usando citometria de fluxo e PCR quantitativo, respectivamente, em várias fases da doença.

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

O objetivo deste protocolo é isolar microvasos de várias regiões do sistema nervoso central de vertebrados lissencefálicos e girofálicos.

Isolamento confiável de micronavios do sistema nervoso central em cinco grupos de vertebrados

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Este manuscrito apresenta um protocolo para induzir encefalomielite autoimune experimental ativa (EAE) em camundongos. Um método de isolamento e caracterização dos linfócitos infiltrados no sistema nervoso central (SNC) também é apresentado para mostrar como os linfócitos estão envolvidos no desenvolvimento da doença autoimune cns.

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.

Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos

Esta pesquisa descreve duas técnicas para isolar abundantes armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) da medula óssea de ratos. Um método combina um kit comercial de isolamento de neutrófilos com centrifugação por gradiente de densidade, enquanto o outro emprega apenas centrifugação por gradiente de densidade. Ambas as abordagens produzem NETs funcionais superando as dos neutrófilos do sangue periférico.

Abordagem única para isolar neutrófilos de medula óssea de rato com capacidade comparável

Até o momento, os protocolos para o isolamento simultâneo de todos os principais tipos celulares residentes no sistema nervoso central do mesmo camundongo são uma demanda não atendida. O protocolo mostra um procedimento aplicável em camundongos ingênuos e experimentais com encefalomielite autoimune para investigar redes celulares complexas durante a neuroinflamação e, simultaneamente, reduzir o número necessário de camundongos.

Isolamento Simultâneo dos Principais Tipos Celulares Residentes no Sistema Nervoso Central de Camundongos Adultos com Encefalomielite Autoimune

Aprenda a isolar células mononucleares do sistema nervoso central de ratos com EAE usando perfusão cardíaca e gradiente de Percoll. Este método remove sangue contaminante e fornece células viáveis para citometria de fluxo e cultura celular.

Isolamento de células mononucleares do Sistema Nervoso Central de ratos com EAE

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