Name: Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Lernen Sie die Synthese lipidbasieter Impfstoff-Nanopartikel zur Induktion antigen-spezifischer CD8+ T-Zell-Expansion in vivo. Diese Methode nutzt Ganztier-Imaging und Fließzytometrie zur quantitativen Analyse immunologischer Reaktionen.

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Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health gewähren 1K22AI097291-01 und von der Nationalen Zentrum für die Förderung der Translational Sciences der National Institutes of Health unter Preis Anzahl UL1TR000433. Wir erkennen auch Prof. Darrell Irvine am MIT und Prof. Matthias Stephan am Fred Hutchinson Cancer Center für ihren Beitrag auf der ersten Arbeiten auf den Impfstoff Nanopartikeln und OT-I / Luc transgenen Mäusen.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden von der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren (UCUCA) an der Universität von Michigan nach den Verhaltensregeln und Richtlinien genehmigt und durchgeführt. Mit Protein-Antigen und Adjuvans Molecules 1. Synthese und Charakterisierung von ICMVs CO bela <ol><li> Mix 1: 1-Molverhältnis von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p maleimidophenyl) butyramido] (MPB) in Chloroform, wobei die Gesamtlipidmenge bei 1,26 umol pro Charge (das heißt, 500 &amp; mgr; g von DOPC und 630 ug MPB) in einem 20 ml Glasröhrchen (Durchmesser = 28 mm und Höhe = 61 mm). </li><li> Hinzuzufügen lipophile Arzneimittel, wie Monophosphoryl-Lipid A (MPLA) oder lipophilen Farbstoffen (zB DID), um die Lipidlösung in gewünschte Konzentration. Gründlich zu entfernen des organischen Lösungsmittels durch Spülen mit extra dry nitrogen Gas- und indem die Proben unter Vakuum O / N. </li><li> Hydratisieren des Lipidfilms durch Zugabe von 200 ul 10 mM Bis-Tris-Propan (BTP, pH 7,0), enthaltend wasserlösliche Medikamente (zB Protein-Antigene). Vortex für 10 Sekunden alle 10 Minuten für 1 Stunde bei RT. </li><li> Übertragen Sie den Inhalt aus dem Glasfläschchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Ort Proben in einem Eis-Wasser-Bad und beschallen kontinuierlich für 5 min mit der Intensität von 40% Einstellung auf einem 125 W / 20 kHz-Sonde-Spitze Ultraschallgerät. </li><li> In 4 ul 150 mM Dithiothreitol (DTT) zu jeder Charge (Arbeitskonzentration 2,4 mM), Wirbel, und kurz Zentrifuge unter Verwendung eines Tischmikrozentrifuge. </li><li> In 40 ul 200 mM CaCl 2 und mit der Pipette (Arbeitskonzentration 33 mM) zu mischen. Proben bei 37 ° C für 1 Stunde zur Vernetzung des MPB-enthaltende Lipidschichten mit DTT zu ermöglichen. </li><li> Centrifuge Proben bei 20.000 · g für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 200 ul ddiH 2 O. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,7 und Zentrifuge wieder nach dem zweiten ddiH 2 O zu waschen, um CaCl 2, nicht umgesetzten DTT und nicht verkapselten Fracht Materialien aus dem Überstand zu entfernen. </li><li> Herstellung von 10 mg / ml 2 kDa Polyethylenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendieren jedes ICMV Probe in 100 ul PEG-SH-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Führen Sie zwei ddiH 2 O Wäschen (Schritt 1.7) und resuspendieren die endgültige ICMV Pellet in PBS und bei 4 ° C. Vor dem Gebrauch mischen ICMV Suspension, als Partikel auf den Boden nach längerer Lagerung zu begleichen. </li><li> Zur Charakterisierung der Partikel, Entnahme einer kleinen Aliquot (~ 10%) der ICMVs aus jeder Charge und einzeln in einem Gesamtvolumen von 1 ml ddiH 2 O verdünnen Platzieren einer einzigen Probe in einem Zetasizer Zelle und Messung Teilchengröße Polydispersitätsindex und Zeta-Potential der Proben unter Verwendung eines DLS und Zetapotential-Messsystem (nach dem Protokoll des Herstellers). </li></ol> 2. Prüfung der Lymphknotens von Fluoreszenz-markierten ICMVs mit konfokale Mikroskopie <ol><li> Vorbereitung der ICMVs mit Fluorophor-markierten Antigen und lipophilen Fluoreszenzfarbstoff beladen <ol><li> Vorbereitung Fluorophor-markierten Protein, wie Ovalbumin mit Alexa Fluor 555-succinimidylester umgesetzt, entsprechend der Anleitung des Herstellers. </li><li> Um ICMVs mit Fluorophor in der Lipidhülle versehen vorzubereiten, fügen lipophilen Fluoreszenzfarbstoff (zB 1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) während der Herstellung der Lipidfilm (Schritt 1.2) mit 0,05% molaren Lipidmenge. Für Lipidfilm Flüssigkeitszufuhr (Schritt 1.3), Verwendung Puffer, der Fluorophor-markierten Antigen und komplette ICMV Synthese wie in Schritten von 1,4 bis 1,11 dargestellt. </li></ol></li><li> Die subkutane Verabreichung von Nanopartikeln an Schwanzbasis <ol><li> Betäuben Maus mit einem kontrollierten Fluss Verdampfer mit einer Induktionskammer u ausgestattettilizing 3% Isofluran und 1,5 l / min Sauerstoff Strom gemäß einer IACUC genehmigt Tier-Protokoll. Sobald die Maus bewusstlos ist, führen Sie folgende Schritte schnell vor der Narkose nachlässt, um optimalen Zugang zu der Stelle der Injektion zu ermöglichen und zu minimieren Beschwerden an das Tier. Alternativ können Sie einen gut passenden Nasenkegel auf die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Wenn Mäuse länger als 5 min narkotisiert, gelten Augenschmier notwendig, Reizung nach dem Eingriff zu minimieren. </li><li> Sprühen Sie die Basis des Schwanzes mit 70% Ethanol zu desinfizieren und nass das Pelzteil das nasse Haar, ein kleines Stück Haut sichtbar, die verwendet werden kann, um die Nadel unter die Haut sichtbar zu schützen. </li><li> Vorbereitung Partikelinjektionssuspension enthaltend gewünschte Menge an Antigen und Adjuvans pro 100 ul Impfdosis in PBS (beispielsweise 10 &amp; mgr; g OVA und 0,3 &amp; mgr; g MPLA pro 100 ul Injektionsdosis wurde in der Vergangenheit 6,9 verwendet wurde). </li><li> Zeichnen Sie die Partikelsuspension intoa Spritze mit einer 27-29 G Nadel und führen Sie die Nadel an der Basis des Schwanzes (~ 5 mm vom Haaransatz) mit der Fase nach oben ein und injizieren 50 ul der Partikelsuspension 22. </li><li> Warten Sie einige Sekunden für Druckausgleich, um übermäßige Rückströmung zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel heraus. Ist die Einspritzung auf der anderen Seite der Schwanzbasis auf beiden Ablaßleisten LNs zielen. </li></ol></li><li> Vorbereitung von Lymphknotengefrierschnitten und Prüfung mit der konfokalen Mikroskopie. <ol><li> Euthanize die Maus mit CO 2 Ersticken, gefolgt von induzierten Pneumothorax nach ein IACUC genehmigten Tier Protokoll. Auszug Leisten LNs nach Protokoll in Bedoya 23 gezeigt und waschen das Blut, indem das Gewebe in 1 ml 4 ° C PBS. </li><li> Absorbieren die PBS aus dem Gewebe mit Gewebe und legen Gewebe in Gewebe cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) an die Spitze vorgefüllt mit Oktober Einfriermedium 24. Snap einfrieren tisverklagen Block in flüssigem Stickstoff für 30 Sekunden. Alternativ legen Gewebeblock auf Trockeneis für 30 min. Speichern gefrorenen Gewebe in -80 ° C Tiefkühltruhe. </li><li> Schneiden Gewebeschnitte 5-10 um dick in einem Kryostat bei -20 ° C 24 gesetzt. </li><li> Falls erforderlich, Immunfluoreszenz Etikettierung, und untersuchen das Gewebe mit der konfokalen Mikroskopie, wie zuvor gezeigt 24. </li></ol></li></ol> 3. Überwachung Expansion von Antigen-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen nach der Nanopartikel-Impfung mit ganzen Tier Imaging <ol><li> Isolierung des OVA 257-264-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen von OT-I / Luc transgenen Mäusen <ol><li> Euthanize eine OT-I / Luc transgene Maus mit CO 2 Ersticken und induzieren ein Pneumothorax nach einem IACUC genehmigten Tier Protokoll. Ernten der Milz steril durch Zugriff auf die Bauchhöhle und sorgfältig Ablösen der Gewebe aus dem Pankreas 23 undin 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS für die Übertragung auf Gewebekultur Kapuze. </li><li> Platzieren der Milz auf einem 70 &amp; mgr; m Nylon-Sieb über ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (bis zu 3 Milz zu einem Zeitpunkt). Verwendung eines Kolbens von einer 3-ml-Spritze, mahlen die Zellen durch das Sieb. </li><li> Waschen Sie den Kolben und das Sieb mit PBS + 2% FBS und entsorgen. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 ml / Milz in der 50 ml Tube, nehmen Sie eine kleine Probe der Zellsuspension mit einem Hämocytometer zählen, und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g. </li><li> Mit einem handelsüblichen Magnet negative Selektion Kit, isolieren die CD8 + T-Zell-Population, indem Sie den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Nach Waschen der Zellen mit PBS, zählen die Anzahl der isolierten CD8 + T-Zellen. Die Reinheit der isolierten CD8 + T-Zellen zu bewerten, inkubieren ~ 20.000-30.000 Zellen in 20 ul Maus CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) für 10 min, anschließend werden 20 ul αCD8-APC-Antikörper (0,005 mg / ml) und Inkubation für 30 min. Perform alle Inkubationen bei 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Zuführen Durchflusszytometrieanalyse 25. </li></ol></li><li> Der adoptive Transfer von isolierten CD8 + T-Zellen und Visualisierung ihrer Expansion nach der Impfung <ol><li> Zuführen adoptiven Transfer von isolierten OT-I / Luc CD8 + T-Zellen in naiven C57BL / 6-Mäusen durch Verabreichung 1-10 x 10 5 Zellen in einem 200 &amp; mgr; l Volumen von PBS durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene 22 (Tag -1). In Anbetracht, dass Pelz und schwarze Flecken auf der Haut in C57BL / 6-Mäuse können mit dem Biolumineszenz-Signal stören, sind rasiert Albino C57BL / 6-Mäuse ideal für diese Studien. </li><li> Nach einem Tag (Tag 0), zur Verwaltung der Impfstoff wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.2). </li><li> Verwalten 150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht der Maus intraperitoneal in einem 300 &amp; mgr; l Volumen von PBS. Nach 10 min zu betäuben die Mäuse mit Isofluran (wie in Schritt 2.2.1) und zu visualisieren OT-I / Luc CD8 + T-Zellen durch den Erwerb der Biolumineszenz-Signal für 5-10 min wit einem ganzen Tier Abbildungssystem (IVIS, siehe Wilson 26 für detaillierte Anleitung). Wiederholen Sie dies für Langzeitstudien wie nötig. </li></ol></li></ol> 4. Peptid-MHC-Tetramer-Färbung von PBMCs für die Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen Anmerkung: Die folgenden Protokollprozedur kann entweder C57BL / 6-Mäuse adoptiv mit OT-I / Luc CD8 + T-Zellen oder C57BL / 6-Mäusen ohne die adoptive Übertragung übertragen geführt werden. <ol><li> Bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Impfung, sammeln etwa 100 ul Blut (4-6 Tropfen) von Mäusen über submandibular Blutungstechnik 27 in ein Rohr mit K 2 EDTA beschichteten und invertieren mehrere Male, um die Gerinnung zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie 100 ul Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml Lysepuffer, und Inkubation für 2 bis 3 min, um die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu entfernen. Centrifuge Proben für 5 min bei 1.500 xg und entfernen Sie den Überstand. Wenn das Pellet noch einppears rot (zeigt unvollständige Entfernung der roten Blutkörperchen), wiederholen Sie die Lyse mit einer kurzen Inkubationszeit (&lt;1 min) Lysepuffer. </li><li> Waschen der verbleibenden PBMCs mit 1 ml FACS-Puffer (PBS + 1% w / v BSA) und Zentrifugieren bei 1500 × g für 5 min. </li><li> Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Probe in 20 ul Maus-CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) zu unspezifisch und FcR-vermittelte Antikörper blockieren die Bindung. Inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Übertragen Zellen von Mikrozentrifugenröhrchen in 4 ml-Rund FACS-Röhrchen. Mit 20 ul H-2K b OVA Tetramer-SIINFEKL-PE-Lösung nach den Angaben des Herstellers zu jeder Probe und inkubiere für 30 min auf Eis. </li><li> Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail (zB αCD8-APC, αCD44-FITC und αCD62L-PECy7 Antikörper (0,005, 0,005 und 0,002 mg / ml-Konzentration, respectively)). In 20 ul zu jeder experimentellen Probe und Inkubation für 20 min auf Eis. Bereiten einzigen Fluorophor Kontrollen labeling Zellen mit jeder Fluorophor-markierten Tetramer oder Antikörper in der oben angegebenen Konzentration. </li><li> Mit FACS-Puffer waschen 2mal und resuspendieren Endpellet in FACS-Puffer, enthaltend 2 ug / ml DAPI. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie-Analyse (Details und Beispiele können in Scheffold 25 zu finden). </li></ol>

Perkin Elmer, sofern die Produktionskosten bei der Veröffentlichung dieses Artikels entstehen.

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines neuen lipidbasierte Nanopartikel System bezeichnet ICMVs und liefert das Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit der Nanopartikel-Impfstoffformulierungen zu Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten induzieren. ICMV Synthese in allen wässrigen Zustand, was ein großer Vorteil ist, verglichen mit anderen gemeinhin verwendeten polymeren Nanopartikelsysteme (zB Poly (lactid-co-glycolid) Säurepartikel), die typischer...

Traditionelle Impfstoffentwicklung hat überwiegend beschäftigt die empirischen Ansatz von Versuch und Irrtum. Jedoch mit der jüngsten Entwicklung einer breiten Palette von Biomaterialien und Entdeckung von molekularen Determinanten Aktivierung des Immunsystems ist es nun möglich, rationell Vakzinformulierungen mit biophysikalische und biochemische Hinweise von Pathogenen 1,2 abgeleitet. Insbesondere wurden verschiedene partikulären Drug-Delivery-Plattformen als Impfstoffträger, da sie mit Untereinheiten-Antigenen und immunstimulierende Mittel gemeinsam geladen werden untersucht, Impfstoffkomponenten Schutz vor Abbau, verbessern und ihre Co-Lieferung an präsentierenden Zellen Antigen (APCs) mit Wohnsitz in der Lymphe Knoten (LNS), damit die Maximierung Immunstimulation und Aktivierung 3-5. In diesem Bericht beschreiben wir die Synthese eines &quot;pathogen-imitiert&quot; Nanopartikel-System, genannt interbilayer netzten multilamellare Vesikel (ICMVs), die zuvor als ein potenter Impfstoff platfor demonstriert wordenm für die Auslösung robust zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und humorale Immunreaktionen sowohl systemische und Schleimhautgewebe Fächer 6-9. Insbesondere erzielte Impfung mit ICMVs wesentlichen Serum-IgG-Ebenen verstärkt gegen eine Malaria-Antigen, gegenüber der Impfung mit üblichen Hilfsmitteln (zB Alaun und Montanide) 7 und auch ausgelöste starke CTL-Antworten gegen Tumorzellen und virale Herausforderung Modellen in Mäusen 9. Hier mit ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikelsystem beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung von Nano-Impfstoff-Formulierungen, einschließlich Partikelgröße und Zetapotentialmessungen und Verfolgung von Menschenhandel zu Partikel Ablassen LNs (DLNs) nutzen konfokale Bildgebung von Gewebe gefriergeschnitten 7. Zusätzlich stellen wir eine Ganztier-Bildgebung basierte Verfahren zum Analysieren Expansion von CTL-Antworten in Mäusen nach dem adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierende Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen 9,10. Schließlich definieren wirRitz Tetramerfärbung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu Längs Quantifizierung der endogenen T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit Nanopartikeln 6,9 geimpft. ICMVs eine lipidbasierte Nanopartikel-Formulierung durch kontrollierte Fusion von Liposomen einfach synthetisiert in multilamellaren Strukturen, die dann chemisch durch Vernetzung Maleimid-funktionalisierten Phospholipid-Kopfgruppen in Lipidschichten mit Dithiol Vernetzer 6 stabilisiert werden. Sobald ICMVs synthetisiert werden, kann ein kleiner Anteil von Nanopartikeln verwendet werden, um Teilchengröße und Zeta-Potential (das heißt, die Oberflächenladung der Teilchen) mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) System und ein Zeta-Potential-Analysegerät ermitteln. DLS misst Änderungen der Lichtstreuung in Partikelsuspensionen, was die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten und die hydrodynamische Größe von Partikeln 11. Konsistente Teilchengröße von Charge zu Charge Synthese kritischDa Teilchengröße gehört zu den wichtigsten Faktoren, die Lymphdrainage Impfstoffpartikel DLNs und anschließende zelluläre Aufnahme durch APCs 12,13. Zusätzlich kann Zetapotential durch Messen der Partikelgeschwindigkeit, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Partikeln und Partikeloberflächenladung 11 können erhalten werden. Konsistente Werte Zeta-Potential von Teilchen ist wichtig, da Oberflächenladung der Teilchen bestimmt, kolloidale Stabilität, die direkten Einfluss auf die Dispersion während der Lagerung und nach der Verabreichung in vivo 14,15 hat. Um die Partikellokalisierungs zu DLNs verfolgen, können ICMVs mit gewünschten Fluorophore einschließlich lipophilen Farbstoffen und kovalent-markierten Antigene bezeichnet werden. Nach der Immunisierung können Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten getötet werden, DLNs reseziert gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von lymphatischen draining sowohl der Nanopartikel Impfstoffträger und Antigen DLNs. Die Gewebeschnitte können zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und verwendet, um weitere Informationen zu erhalten, wie die Typen von Zellen mit dem Antigen, und die Bildung von Keimzentren assoziiert gefärbt, wie wir vorher 7 gezeigt werden. Sobald die Partikelsynthese optimiert und Handels den DLNs bestätigt wird, ist es wichtig, Auslösung in vivo CTL-Expansion zu validieren. Um Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen als Reaktion auf die Impfung Nanopartikel zu analysieren, haben wir eine Modellantigen, Ovalbumin (OVA) verwendet, die mit OVA 257-264-Peptid (SIINFEKL) immun CD8 + T-Zell-Epitop, das detaillierte immunologischen Analysen ermöglicht von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für die anfängliche Entwicklung von Impfstoffen 16,17. Insbesondere, um die Dynamik der Expansion und Migration von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen zu befragen, erzeugten wir haben eindoppelt transgenen Mausmodell durch Kreuzung Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden transgenen Mäusen (Luc) mit OT-I-transgenen Mäusen, die CD8 + T-Zellen mit T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für SIINFEKL (in Verbindung mit H-2K b) besitzen. Aus diesen OT-I / Luc Mäusen, Luciferase-exprimierenden kann OT-I CD8 + -T-Zellen isoliert und zur adoptiven Transfer in naiven C57BL / 6-Mäusen hergestellt werden. Sobald ausgesät werden erfolgreiche Immunisierung mit OVA haltigen Nanopartikeln in Expansion der übertragenen T-Zellen, die durch die Überwachung des Biolumineszenz-Signals mit einem ganzen Tier Abbildungssystems 9,10 verfolgt werden können führen. Diese nicht-invasive Ganzkörper-Bildgebung Technik hat mit anderen viralen oder Tumorantigene, die in der Vergangenheit 18-20 angewandt, sodass Prozesse in T-Zell-Expansion in Lymphgewebe und Verbreitung in die peripheren Gewebe in Längs Weise beteiligt. Komplementär zur Analyse adoptiv transferierte Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen, endogenous T-Zell-Reaktionen nach der Impfung mit dem Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Tetramer-Assay 21, bei dem ein Peptid-MHC-Tetramer-Komplex, bestehend aus vier Fluorophor-markierten MHC-Klasse I-Moleküle mit Peptid beladen Epitope untersucht werden, wird verwendet, TCR und Etiketten CD8 + T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu binden. Der Peptid-MHC-Tetramer-Assay kann entweder im Terminal Nekropsie Studien zur Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in lymphoiden und peripheren Gewebe zu identifizieren oder in Langzeitstudien mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von der seriellen Blutabnahmen durchgeführt werden, erhalten. Nach Färbung Lymphozyten mit Peptid-MHC-Tetramer, Durchflusszytometrie Analyse wird für detailliertere Analysen auf den Phänotyp von CTLs oder Quantifizierung ihrer Häufigkeit bei CD8 + T-Zellen durchgeführt.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Synthese und Charakterisierung von ICMVs, die mit Proteinantigen- und Adjuvansmolekülen beladen sind</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramid] (Natriumsalz) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Monophosphoryllipid A (synthetisch) (PHAD&Trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Glasfläschchen</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny Vakuumofen</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris Propan (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Ultraschallgerät (125&nbsp; W/20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa Thioliertes Polyethylenglykol (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Küvetten</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. Untersuchung der Lymphknotendrainage von fluoreszenzmarkierten ICMVs mit konfokaler Mikroskopie</strong</td></tr><tr><td>>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanin, 4-Chlorbenzolsulfonatsalz (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidylester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Gefriermedium</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Gewebe-Kryoformen</td><td>VWR</td><td>25608-922<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">3. Überwachung der Expansion von antigenspezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8+ T-Zellen nach Nanopartikel-Impfung mit Ganztier-Imaging</td></tr><tr><td>C57BL/6 Mäusen</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 Mäuse</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 Mäuse</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Nylon-Sieb</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Maus CD8+ T-Zell-Isolationskit</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; Ganztier-Bildgebungssystem</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. Peptid-MHC-Tetramerfärbung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) für die durchflusszytometrische Analyse von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen</td></tr><tr><td>K2EDTA-Röhrchen</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK-Lysepuffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Block</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetramer</td><td></td><td>MBL TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6- Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn Durchflusszytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole-tier imaging und fließzytometrieverfahren zur analyse von antigen-spezifischen cd8 + t-zellantworten nach der nanopartikel-impfung

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditionelle Impfstoff-Adjuvantien, wie z.B. Alaun, lösen suboptimale CD8+ T-Zell-Antworten aus. Um diese große Herausforderung bei der Impfstoffentwicklung zu bewältigen, wurden verschiedene Nanopartikelsysteme entwickelt, die Eigenschaften von Krankheitserregern nachahmen, um die Antigenabgabe an drainierende Lymphknoten zu verbessern und die Antigenaufnahme durch antigenpräsentierende Zellen zu erhöhen, was zu neuen Impfstoffformulierungen führte, die für die Induktion antigenspezifischer CD8+ T-Zellantworten optimiert sind. In diesem Artikel beschreiben wir die Synthese eines "pathogen-imitierenden" Nanopartikelsystems, das als interbilayer-vernetzte multilamellare Vesikel (ICMVs) bezeichnet wird und als wirksamer Impfstoffträger für die gemeinsame Verabreichung von Untereinheitsantigenen und immunstimulierenden Wirkstoffen und die Auslösung potenter zytotoxischer CD8+ T-Lymphozyten (CTL)-Reaktionen dienen kann. Wir beschreiben Methoden zur Charakterisierung der hydrodynamischen Größe und Oberflächenladung von Impfstoff-Nanopartikeln mit dynamischer Lichtstreuung und Zetapotentialanalysator und stellen ein konfokalmikroskopisches Verfahren zur Analyse der Nanopartikel-vermittelten Antigenabgabe an drainierende Lymphknoten vor. Darüber hinaus zeigen wir eine neue Biolumineszenz-Bildgebungstechnik für ganze Tiere, die den adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierenden, antigenspezifischen CD8+ T-Zellen in Empfängermäuse nutzt, gefolgt von einer Nanopartikelimpfung, die eine nicht-invasive Abfrage von Expansions- und Transportmustern von CTLs in Echtzeit ermöglicht. Wir beschreiben auch die Tetramerfärbung und die durchflusszytometrische Analyse von mononukleären Zellen des peripheren Blutes zur longitudinalen Quantifizierung endogener T-Zell-Antworten bei Mäusen, die mit Nanopartikeln geimpft wurden.

Die bei der Synthese von ICMVs beteiligten Schritte sind in Figur 1 6 gezeigt. Kurz gesagt wird ein Lipidfilm keine lipophilen Arzneimitteln oder Fluoreszenzfarbstoffe enthält in Gegenwart von hydrophilen Arzneimitteln hydratisiert. Zweiwertige Kationen, wie Ca 2+, werden zugegeben, um die Fusion von anionischen Liposomen in multilamellaren Vesikeln zu fahren. Dithiol-Vernetzer, wie beispielsweise DTT, auf apposing Lipidschichten und schließlich verbleibenden externen Maleimidgrupp...

Wir beschreiben Ganztier-Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Techniken zur Überwachung der Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen als Reaktion auf die Immunisierung mit Nanopartikeln in einem Mausmodell der Impfung.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, lipidbasierte vakzine Nanopartikel zu synthetisieren und zu charakterisieren sowie deren Fähigkeit zu bewerten, in vivo eine antigen-spezifische Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten hervorzurufen. Dies wird erreicht, indem pathogenmimetische interbilagige, vernetzte multilamellare Vesikel oder I-CMVs, die gemeinsam mit Antigen und Adjuvans beladen sind, zur Impfung naiver Mäuse eingesetzt werden. Adoptiv übertragene, Luciferase exprimierende, antigenspezifische CD8-positive T-Zellen.Im zweiten Schritt wird die Expansion der antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen mittels Ganzkörper-In-vivo-Bildgebung evaluiert. Aus peripherem Blut gewonnene mononukleäre Zellen von ICMV-immunisierten Tieren werden anschließend mit fluoreszenzmarkierten Tetrameren gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Häufigkeit der endogenen, antigenspezifischen CD8-positiven T-Zellen im systemischen Kompartiment zu quantifizieren. Letztendlich kann eine biolumineszente Bildgebung verwendet werden, um die Expansion der antigenspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten als Reaktion auf die Nanopartikelimpfung zu verfolgen.Mit diesen Methoden können wichtige vorläufige Fragen in der Impfstoffentwicklung beantwortet werden, beispielsweise wie stark die Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten ausfällt und wie diese Zellen auf Nanopartikelimpfungen hin in verschiedene Gewebe wandern. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der In-situ-T-Zell-Analyse nach Gewebenekropsie, liegt darin, dass die in-vivo-Bildgebung der T-Zell-Antwort nicht invasiv ist. Dies ermöglicht die longitudinale Überwachung desselben Tieres. Beginnen Sie damit, ein molares Verhältnis von eins zu eins von DOPC und MPB in Chloroform zu mischen, wobei eine Gesamtlipidmenge von 1,26 Mikromol pro Ansatz in einer 20-Milliliter-Glasflasche beibehalten wird.Fügen Sie anschließend den lipophilen Wirkstoff in der gewünschten Konzentration zur Lipidlösung hinzu und spülen Sie die Lösung mit zusätzlichem trockenem Stickstoffgas, um das organische Lösungsmittel vollständig zu entfernen. Stellen Sie die Probe über Nacht unter Vakuum. Am nächsten Morgen geben Sie 200 Mikroliter einer 10-Millimolar-BTP-Lösung, die den wasserlöslichen Wirkstoff der Wahl enthält, zu, um den Lipidfilm zu hydratisieren. Wirbeln Sie die resultierende Lösung alle 10 Minuten für jeweils 10 Sekunden eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Überführen Sie danach den Inhalt in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Als Nächstes wird das Röhrchen in ein Eiswasserbad gegeben und unter kontinuierlicher Beschallung mit der Intensitätseinstellung von 40 % an einer 125-Watt-20-kHz-Sondenkuppe soat durchgeführt. Nach fünf Minuten werden vier Mikroliter 150 Millimolar DTT zum Röhrchen gegeben, vortexiert, um es zu mischen, und die Probe in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert. Anschließend werden 40 Mikroliter 200 Millimolar Calciumchlorid in die Probe gegeben, gefolgt von der Vernetzung der MPB-haltigen Lipidschichten mit DTT bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Am Ende der Inkubation die Lösung dreimal zentrifugieren, wobei bei der zweiten und dritten Zentrifugation jeweils 200 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser hinzugefügt wird, um verbleibendes Calciumchlorid, nicht umgesetztes DTT und nicht eingeschlossene Frachtmaterialien aus dem Überstand zu entfernen. Nach dem letzten Zentrifugationsschritt suspendieren wir die I-CMVs in 100 Mikrolitern frisch zubereitetem Pegol für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend die Vesikel noch zweimal mit doppelt destilliertem Wasser waschen.Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in PBS und lagern Sie die ICMV bei vier Grad Celsius. Zum Charakterisieren der Partikel mischen Sie die kalte ICMV-Suspension, bevor Sie eine kleine Aliquotmenge der Probe in einem Gesamtvolumen von einem Milliliter doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Anschließend geben Sie die ICMVs in eine Zeta-Sizer-Zelle und messen mithilfe eines Systems zur dynamischen Lichtstreuung und zur Bestimmung des Zeta-Potentials gemäß den Herstelleranweisungen die Partikelgröße, den Polydispersitätsindex und das Zeta-Potential der Proben.Um Luciferase-exprimierende CD8-positive T-Zellen aus Eizellen zu isolieren, zunächst die Milzen aus OT-I-Luciferase-transgenen Mäusen gewinnen. Die Gewebe in fünf Milliliter kalte PBS mit 2 % FBS geben und anschließend in eine Gewebekulturhaube stellen.Verwenden Sie den Kolben einer 3-Milliliter-Spritze, um bis zu drei Milzen gleichzeitig durch einen 70-Mikron-Filter in ein 15-Milliliter-Konischglas zu zerkleinern. Spülen Sie den Kolben und den Filter mit PBS und 2 % FBS aus. Anschließend wird das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf 10 Milliliter pro Milz aufgefüllt.Bestimmen Sie die Gesamtzellzahl und pelletieren Sie anschließend die Zellen. Verwenden Sie danach ein handelsübliches magnetisches Negativselektionskit, um die CD8-positiven Milzzellen gemäß den Herstelleranweisungen zu isolieren. Waschen Sie die T-Zellen anschließend in PBS.Zählen Sie sie und inkubieren Sie zwei- bis dreimal 10 hoch fünf der Zellen in 20 µL Maus-CD1632-Blockierantikörper. Nach 10 Minuten geben Sie 20 µL Anti-CD8a-APC-Antikörper zu den Zellen hinzu und inkubieren 30 Minuten lang. Überprüfen Sie die Reinheit der magnetisch isolierten, CD8-positiven T-Zell-Population mittels Durchflusszytometrie. Übertragen Sie anschließend ein- bis zehnmal 10 hoch fünf OT-I-Luciferase-CD8-positive T-Zellen adoptiv in naiv rasierter albino C57BL/6-Maus in 200 µL PBS über intravenöse Schwanzveneninjektion. 24 Stunden später verabreichen Sie den Impfstoff zum entsprechenden Zeitpunkt nach Impfung.Spritzen Sie den Tieren 150 Milligramm pro Kilogramm Lucifer nach 10 Minuten, erfassen Sie das Biolumineszenzsignal für fünf bis 10 Minuten mit einem Ganzkörper-Bildgebungssystem, um die OT-eins-Lucifer-CD-acht-positiven T-Zellen sichtbar zu machen, um die Anzahl der antigenspezifischen CD-acht-positiven T-Zellen zum geeigneten Zeitpunkt zu bestimmen. Sammeln Sie nach der Impfung etwa 100 Mikroliter Blut von den geimpften Mäusen mittels der submandibulären Blutentnahmetechnik in ein mit Kalium-EDTA beschichtetes Röhrchen und drehen Sie das Röhrchen mehrmals um, um eine Gerinnung zu verhindern. Überführen Sie anschließend 100 Mikroliter Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie ein Milliliter eines CK-Lysepuffers hinzu.Nach zwei bis drei Minuten die Zellen zentrifugieren und den Überstand entfernen. Die verbleibenden PBMCs in einem Milliliter Fax-Puffer waschen und die unspezifische Bindung mit CD16/32, wie gerade gezeigt, blockieren. Nach 10 Minuten die Zellsuspension auf vier Milliliter-Rundboden-Fax-Röhrchen aufteilen und je nach Herstellerangaben 20 Mikroliter H2-Kb/OVA-Tetramer-PE-Lösung zu jeder Probe hinzufügen.Nach 30 Minuten auf Eis fügen Sie 20 Mikroliter des entsprechenden Antikörpercocktails zu jeder experimentellen Probe und die einzelnen Fluoro-Vier-Kontrollantikörper für jeden Fluoro-Vier-Tag-Tetramer oder Antikörper zu jeder Kontrollprobe hinzu. Schließlich, nach einer weiteren 20-minütigen Inkubation, waschen Sie alle Proben in Fax-Puffer, resuspendieren die Pellets in Fax-Puffer, der mit DPI ergänzt wurde, und analysieren die Proben per Durchflusszytometrie. I-CMVs, die gemeinsam mit Fluoro-Vier-Takt-Proteinantigenen und fluoreszierenden lipophilen Farbstoffen beladen wurden, ermöglichen die Visualisierung der Antigen- und Nanopartikelabgabe in vivo. Beispielsweise zeigt die konfokale Mikroskopie-Aufnahme, dass lösliches Antigen, das subkutan an der Basis des Schwanzes verabreicht wurde, innerhalb von vier Stunden die drainierenden Lymphknoten erreicht und innerhalb von 24 Stunden abgebaut ist.Im Gegensatz dazu werden überladene I-CMVs erstmals 24 Stunden nach der Verabreichung am Rand der drainierenden Lymphknoten nachgewiesen, wobei eine anhaltende Akkumulation zu einer starken Ablagerung von Ova-I-CMVs im drainierenden Lymphgewebe führt. Am vierten Tag zeigt in der Tat die Biolumineszenzbildgebung von C57BL/6-Mäusen, denen am Tag der Impfung OT-I-Luciferase-CD8-positive T-Zellen adoptiv übertragen wurden, einen minimalen Grundsignalpegel von OT-I-Luciferase-T-Zellen am vierten Tag nach der Impfung. Mäuse, die jedoch mit den Ova-MPI-CMVs immunisiert wurden, weisen ein starkes Biolumineszenzsignal in den drainierenden inguinalen Lymphknoten auf.Die mit löslichem Ova geimpften Mäuse hingegen zeigen eine deutlich verminderte Expansion der OT-I-Lucifer-CD8-positiven T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten. Darüber hinaus weisen Mäuse, die mit löslichem Ova und MPLA immunisiert wurden, ohne adoptive Übertragung antigenspezifischer T-Zellen, keine nennenswerte Expansion ovaspezifischer CD8-positiver T-Zellen auf, wie die wöchentliche Überwachung der PBMCs zeigte. ICMV-Impfungen hingegen lösen eine signifikant stärkere endogene CD8-positive T-Zell-Antwort aus, die bis zum Tag 41 einen Höhepunkt mit 28 % tetramerpositiver T-Zellen innerhalb des CD8-positiven T-Zell-Kompartiments in den PBMCs erreicht. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man lipidbasierte Nanopartikel synthetisiert, Impfungen durchführt und die Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) in vivo sichtbar macht und quantifiziert.Diese Methoden können weiter modifiziert werden, um zusätzliche Informationen über die CTL-Antwort zu erhalten. Beispielsweise kann der Teer-Färbungs-Assay durch zusätzliche Marker wie CD127, BCL-2 und KLRG1 ergänzt werden, um das Gedächtnis-Phänotyp der Zellen zu bewerten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von seltenen Antigen-spezifischen CD8+ T-Zellen unter Verwendung von magnetischen Nanopartikel-basierten künstlichen antigenpräsentierenden Zellen (aAPCs), die mit antigenen, peptidbeladenen MHC-Igs und Anti-CD28-Antikörpern funktionalisiert sind. Die Interaktion der aAPCs mit CD8+ T-Zellen, die spezifisch die antigenen Peptid-Targeting T-Zell-Rezeptoren exprimieren, gefolgt von deren Expansion in vitro, führt zur Anreicherung und Expansion...

Nanopartikelbasierte Anreicherung und Expansion von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Analyse von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen in verschiedenen Zellzyklusstadien. Fluoreszenzmarkierte lebensfähige Zellen werden mittels Durchflusszytometrie selektiert, und die Zellen in den verschiedenen Zellzyklusstadien werden anhand ihres DNA-Gehalts mit Antikörpern gegen zellproliferationsassoziiertes Kernprotein und einer Nukleinsäurefärbung identifiziert.

Ein Assay für die Zellzyklusanalyse von antigenspezifischen CD8+ T-Zellen

Das Video zeigt eine immunologische Methode zur Überwachung der in vivo adjuvansinduzierten zytotoxischen T-Lymphozyten- oder CTL-Produktion. Einer Maus werden gentechnisch veränderte, proliferative Farbstoff-gefärbte CD8+ T-Spender-Lymphozyten vorinjiziert. Die subkutane Injektion von Ovalbumin mit Adjuvantien erzeugt zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die nach der Entnahme durch Immunfärbung und Durchflusszytometrie identifiziert werden.

Eine immunologische Technik zur Überwachung der adjuvansvermittelten zytotoxischen T-Lymphozytenbildung

Dieses Video demonstriert eine in-situ Fluoreszenz-Multispektral-Bildgebungstechnik zur Analyse verschiedener Subpopulationen von infiltrierenden T-Zellen im Tumorgewebe. Eine Kryosektion des Nierenzellkarzinoms wird mit Antikörpern behandelt, um CD8+ T-Zellen zu markieren, die spezifische inhibitorische Rezeptoren exprimieren und einen immuntherapieresistenten Phänotyp aufweisen. Der markierte Schnitt wird mit einem Multispektralmikroskop visualisiert, um die unterschiedlichen CD8+...

Multiplex-Immunfluoreszenz-Bildgebung zur Analyse immuntherapieresistenter T-Zell-Subpopulationen

Analyse der Nanopartikel Wechselwirkung mit definierten Untergruppen der Immunzellen durch Durchflusszytometrie.

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erforderlich sind, um die ex vivo-Validierung von in vivo Nahinfrarot-Fluoreszenz-Xenotransplantat-Bildgebungsexperimenten an Mäusen unter Verwendung von Fluorophor-markierten Nanobodies und konventionellen Antikörpern durchzuführen.

Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte<em&gt; In-vivo-</em&gt; Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden<em&gt; Ex vivo</em&gt; Durchflusszytometrie und Mikroskopie

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren zur Alloreaktivität in einer gemischten Population von T-Zellen unter Verwendung von Mess Cytometry Abbildungsströmung.

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

Das Ziel dieses Protokolls ist es, für die Erkennung von in Vivo Antigen-spezifische Tötung einer Ziel-Zelle in einem Mausmodell ermöglichen.

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Ex Vivo qualitativen Nachweis von Antigen-spezifischen CD8+ T Zellen. Analyse ist möglich mit einzelnen Zellsuspensionen von Organen oder geringe Mengen von Blut. Ein breites Spektrum an Studiengängen erfordert die Analyse der zytotoxischen T-Zell-Antworten (Impfung und Krebs-Immuntherapie-Studien).

Gleichzeitige Quantifizierung von Anti-Vektor- und Anti-Transgen-spezifische CD8+ T Zellen über MHC Tetramer Färbung nach der Impfung mit viralen Vektoren

Wir beschreiben hier einen in vivo tötenden Assay basierenden Strömungszysam, der die Untersuchung der Immunodominanz in zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) auf ein Modell-Tumor-Antigen ermöglicht. Wir stellen Beispiele dafür zur Verfügung, wie dieser elegante Test für mechanistische Studien und für die Wirksamkeit von Medikamenten eingesetzt werden kann.

Schneider In Vivo Cytotoxicity Assays zur Untersuchung von Immunodominanz in modularspezifischen CD8+ T Cell-Reaktionen

Die klonale Expansion ist ein Schlüsselmerkmal der antigenspezifischen T-Zell-Antwort. Der Zellzyklus von Antigen-reagierenden T-Zellen wurde jedoch schlecht untersucht, teilweise aufgrund technischer Einschränkungen. Wir beschreiben eine durchflusszytometrische Methode zur Analyse klonal expandierender Antigen-spezifischer CD8-T-Zellen in Milz und Lymphknoten geimpfter Mäuse.

Ein DNA/Ki67-basierter Durchflusszytometrie-Assay zur Zellzyklusanalyse von Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen bei geimpften Mäusen

Lernen Sie die Synthese lipidbasieter Impfstoff-Nanopartikel zur Induktion antigen-spezifischer CD8+ T-Zell-Expansion in vivo. Diese Methode nutzt Ganztier-Imaging und Fließzytometrie zur quantitativen Analyse immunologischer Reaktionen.

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung (Video) | JoVE Journal

Whole-Tier Imaging und Fließzytometrieverfahren zur Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten nach der Nanopartikel-Impfung

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