Hemogenic内皮细胞直接诱导和血液中转录因子在人多能干细胞表达

该程序的总体目标是通过强制表达转录因子从人多能干细胞中产生红细胞和髓细胞。该方法适用于血细胞中均质内皮的产生，用于研究内皮到 hepo 的转变以及 hepo 发育和规范的转录调控。该技术的主要优点是该方法提供了从人 preport 干细胞进行均质内皮诱导的低效和快速方法，并允许在细胞培养皿中观察内皮半质转变。

Dr.Br.Lin 实验室的研究助理 Dr.Bruske 将演示该程序 在开始之前，根据制造商的说明稀释 preco 六个壁板，例如垫状凝胶，然后将其倒入孔中。将板在 37 摄氏度下孵育 30 至 60 分钟，用于转导培养基。首先，为每个转导组准备慢病毒等分试样，使得估计的感染复数或病毒对细胞的 MOI 为每个细胞一个病毒，并将它们保持在 4 摄氏度。

接下来，将 hbsc 病毒多脑完全无血清培养基混合至终浓度为 6 微克/毫升，岩石抑制剂 Y 2 7 6 3 2 至终浓度为 10 微摩尔，每个转导组的总体积为 1.3 毫升，并将混合物置于冰上以制备细胞。从最后一次传代后约 4 天汇合度为 70% 的健康批次多能干细胞开始。如果人类多能干细胞维持在 MAP 中，则必须在转导实验前两到三次传代将其转移到无饲养层条件下，并代表健康的多能干细胞培养物。

无自发分化。吸出 HPSC 培养基，并在 6 孔板的每孔中加入 2 毫升盐分离溶液，例如 Accutane，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 5 到 7 分钟。然后加入 2 毫升含 10 微摩尔岩石抑制剂的完全培养基，并收集分离的细胞。

制备均质细胞悬液后，取小等分试样，并通过 Trian 蓝排除法计数活细胞。接下来，将细胞以 200 倍 G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于含有 10 微摩尔岩石抑制剂的完全培养基中，终浓度为 3.4 倍 10，至每毫升 6 个活细胞中。然后将 200 微升含有 0.68 倍 10 的细胞悬液添加到六个细胞中，分别添加到先前制备的 1.3 毫升转导培养基中。

将涂有矩阵的六块墙板从 37 摄氏度移开。接下来，吸出基质溶液，将每种转导混合物转移到孔中，并旋转板以使细胞在孔中均匀分布。24 小时。

转导后，在显微镜下观察孔，以确保至少 80% 的细胞粘附。弃去病毒溶液，用不含任何生长因子的不完全培养基洗涤贴壁细胞。接下来，向细胞中加入 3 毫升补充有细胞因子的培养基，称为 3 F.Medium。

第二天将细胞孵育过夜。用每毫升含有 1 微克 pur 霉素的新鲜 3 种 F 培养基更换培养基。消除残留的 nont 转导细胞。

每 24 小时更换一次该培养基以去除死细胞。治疗 48 小时后，停用 pur mycin，并在第 4 天仅使用新鲜的 3 F 培养基。转导后，在显微镜下观察细胞是否出现具有内皮形态的成簇细胞，以确定血内皮细胞的形成。

首先，将培养皿中第 3 天或第 4 天的细胞与细胞分离溶液相关联。在完全培养基中收集分离的细胞并离心，在室温下将细胞重悬于最大缓冲液中，并在血细胞计数器中计数细胞，然后用合适的抗体孵育一次 10 至第 5 个细胞，用于检测 V catrin、CD 2 26、CD 73 和 CD 43。细胞表面标志物。

从第四天开始，文本方案中描述了进行流式细胞术。转导后，通过从每个孔中更换一半的培养基来继续分化细胞，每 48 小时在 5 到 7 天之间，圆形血细胞将出现松散聚集并重新归档在内皮细胞层上方。将培养物维持长达 14 天，在此期间，漂浮细胞应显着膨胀。

ETV 2、gata 1 和 ETV 2 的流式细胞术分析。Gata 2 转导细胞显示 terin 阳性血内皮的形成，这可以通过 ETV 2、gata 1 和 ETV 2 的分化流式细胞术分析第 3 天至第 4 天时 CD 2 26 的表达和 CD 73 表达的缺乏来鉴定。Gata 2 转导的细胞在第 7 天显示诱导表达 CD 43 的血细胞。

转导后第 14 天 gata 2 TAL 1 LMO 2 诱导细胞的流式细胞术分析显示表达 CD 2 35 A 和 CD 41 A 的血细胞形成 gata 2 TAL 1 lmo 2 诱导的造血细胞的右染色胞嘧啶制剂在集落形成细胞测定中显示红细胞巨噬细胞和巨龋酸性细胞形态。在进行转导程序时，可以在不到一个小时的时间内完成人类多能干细胞的转导。重要的是要考虑干细胞活力，始终在反应混合物中加入 rock 抑制剂，并在前三天后每个细胞使用最佳数量的病毒。

转导后可以进行免疫染色、结肠形成 asay 和流式细胞术等方法，以回答有关分化效率和诱导的血液转移类型的问题。观看此视频后，您应该对如何化和感染人类多能干细胞以及在前 7 到 10 天内分化培养物的预期结果有很好的了解。在转录因子成功递送到人类 Purport 干细胞中后，细胞失去了其效力并逐渐走向造血命运。

因此，研究人员将拥有一个方便的体外模型来研究内皮细胞到造血细胞转变的分子机制。不要忘记，在含有慢病毒的区域工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备和正确处理含有病毒的区域。