Purificação de embarcações do cérebro do rato

O objetivo geral do procedimento é purificar o compartimento vascular do cérebro do camundongo, mantendo sua integridade estrutural, usando uma série de centrifugações e filtrações de baixa velocidade sem a necessidade de anticorpos específicos ou cepas transgênicas. Muitos esforços têm sido feitos para desenvolver técnicas que permitam investigações celulares, moleculares e farmacológicas da barreira hematoencefálica. A ausência de separação, gradientes, cólons ou etapas de centrifugação de alta velocidade torna a purificação dos vasos cerebrais por este procedimento muito fácil, rápida e barata.

Os vasos cerebrais permanecerão estruturalmente intactos com as células endot seladas por junção tag e cercadas pelos parasitas lanares basais, células vasculares S a maioria das células musculares e membranas astrológicas perivasculares. Este protocolo pode ajudar a responder a questões-chave sobre a função do compartimento vascular CE e permitir o estudo de sua composição molecular, demonstrando que o procedimento será um pós-doutorado da equipe de Martin Coen S. Antes de iniciar o procedimento, corte a parte inferior da parte superior do porta-filtro.

Em seguida, use um bisturi para inci a pele do pescoço do camundongo até o nariz e puxe a pele para trás. Lave o crânio com PBS para remover quaisquer pelos contaminantes e, em seguida, insira uma tesoura no crânio anterior aos bulbos olfatórios. Abra a tesoura para romper o crânio em partes e remova o cérebro com a espátula.

Em seguida, disseque o plexo coróide dos ventrículos laterais e transfira o cérebro para um béquer de 150 mililitros contendo 20 mililitros de solução B one no gelo. Em seguida, use dois bisturis para cortar vigorosamente o cérebro em fragmentos de tecido de dois milímetros e use um homogeneizador automatizado para homogeneizar o tecido por 20 golpes a 400 RPM no gelo. Para purificar os vasos, transfira o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 mililitros e gire a pasta de tecido.

Em uma centrífuga de rotor oscilante, uma grande interface branca consistindo principalmente de mielina se formará na parte superior do pellet do recipiente. Rejeitar o sobrenadante a 20 mililitros de solução gelada de B dois e agitar vigorosamente o tubo durante um minuto. Após uma segunda centrifugação, a mielina formará uma camada branca densa na superfície do sobrenadante.

Gire lentamente o tubo para permitir que a solução B dois corra ao longo da parede à medida que é derramada e descarte a mielina com o sobrenadante. Em seguida, use uma pipeta de plástico embrulhada em papel absorvente para remover qualquer fluido residual das paredes do tubo. Tomando cuidado para não tocar no pellet do recipiente e virar o tubo de cabeça para baixo no gelo.

Em seguida, resus, suspenda o pellet em um mililitro de solução gelada de B três, seguido da adição de mais cinco mililitros de solução de B três, tomando cuidado para que os vasos não formem agregados. Agora coloque um filtro de malha de náilon de 20 mícrons em cima de um frasco de Becker e equilibre o filtro com 10 mililitros de solução B três gelada. Despeje a preparação do recipiente no filtro e enxágue cuidadosamente os recipientes com mais 40 mililitros de solução B três gelada.

Em seguida, use uma pinça limpa para transferir imediatamente o filtro para um béquer contendo 30 mililitros de solução B três fresca e prenda os recipientes do filtro com uma agitação suave. Despeje o conteúdo do béquer em um tubo de plástico de 50 mililitros. Em seguida, após uma centrifugação, suspenda novamente o pellet em um mililitro de solução gelada de B três antes da imunocoloração.

Transfira os vasos para tubos de PCR de 0,2 mililitro e coloque os tubos no gelo até que o tecido sedimente no fundo dos tubos. Em seguida, use pontas de carregamento de gel para aspirar a maior parte do líquido. Em seguida, insira um capilar de vidro siliconizado de 40 micrômetros em uma ponta de pipeta P 200 e use o capilar para transferir os recipientes para uma lâmina de vidro quando os recipientes estiverem assentados, remova cuidadosamente o líquido com um pedaço de papel absorvente.

Em seguida, carregue uma única gota de meio de montagem nos recipientes e aplique uma lamínula em um ângulo de 45 graus, permitindo que o meio de montagem se espalhe ao longo da borda do vidro até que a lamínula esteja no lugar. Nesta imagem, a marcação contínua do NIR ao redor das células endoteliais neurais pode ser observada, confirmando a retenção da lâmina basal nos vasos purificados. Componentes das junções endoteliais apertadas, como ZO um, também são detectados nos vasos purificados.

Além disso, NG dois e a marcação de actina de músculo liso indicam a retenção de parasitas intactos e células musculares lisas vasculares, respectivamente. A conexão das proteínas da membrana astroglial perivascular 43 e Aquaporina quatro também são detectadas na superfície dos vasos purificados, demonstrando a retenção adicional das membranas perivasculares dos astrócitos durante o processo de purificação, apenas fibras positivas para GFAP dispersas e curtas, no entanto, são observadas nos vasos isolados, revelando que os corpos celulares dos astrócitos não são copurificados. Apenas algumas fibras neuronais permanecem ligadas aos vasos.

Da mesma forma, as células positivas IBA um e oli dois também não são detectadas, confirmando que a microglia e os oligodendrócitos não são copurificados. Recomendamos fortemente a remoção do plexo atual antes da homogeneização do cérebro, pois o experimentamos como uma possível fonte de contaminação, trabalhe em uma área limpa e evite a contaminação por cabelo e poeira. Como os anticorpos têm uma alta afinidade inespecífica por esses materiais.

Também é importante sempre realizar uma coloração nuclear. É possível remover as células sanguíneas dos vasos purificados realizando perfusão intracardíaca com PBS antes da extração do vaso. Extraímos com sucesso ares e proteínas de vasos purificados por este procedimento de paletas de vasos recém-preparados ou congelados.

Também usamos sondas fluorescentes e microscopia confocal para estudar a função de transporte endotelial ex vivo dos vasos. Desejamos-lhe boa sorte com seus experimentos.