Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Bu video makalesinin genel amacı, mikroplaka tabanlı tric analizlerinde kullanılmak üzere, küçük miktarlardaki fare iskelet kasından yüksek kaliteli mitokondrileri izole etmektir. Bu yöntem, belirli ilaçların ve proteinlerin iskelet kası mitokondriyal oksijen tüketimini nasıl modüle ettiğinin açıklanması gibi biyomedikal araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, daha önce bildirilenlerden daha küçük miktardaki fare iskelet kasından yüksek kaliteli mitokondrilerin izole edilebilmesidir.

Fareye kurum yönergelerine uygun şekilde ötanazi uygulayın. Ardından fareyi yan tarafına yatırın ve ince uçlu makas kullanarak, femur lateral epikondilinin üzerine denk gelecek şekilde ciltte bir insizyon yapın.

Deriyi fareye doğru soyun ve ardından quadriceps başlangıç noktasının üzerinde yer alan yağ pedini çıkarın. Daha sonra, patellaya tutunmuş olan quadriceps tendonunu kesin. Femoral arteri koruyarak kemik ile quadriceps arasındaki aponevrozu yavaşça kesin.

Ardından, quadriceps kasını serbest bırakmak için tendonu femur üzerindeki başlangıç noktasından kesin ve quadriceps kasını soğutulmuş PBS içine yerleştirin. Quadriceps üzerindeki görünür tüm yağ dokularını bir makas yardımıyla temizleyin. Temizleme işlemi bittikten sonra, kasın femurun üzerinde kalan kısmı yukarı bakacak şekilde quadriceps'i ters çevirin.

Kuadriceps kasını penset yardımıyla yelpaze şeklinde açın. Her lobdan görünen iki kırmızı kas kısmını çıkarın ve beş mililitre soğutulmuş mitokondri izolasyon tamponu içeren bir behere yerleştirin.

Sırada, aşil tendonunun üzerindeki deriyi ince uçlu makasla kesin ve deriyi fareye doğru soyun. Açığa çıkan aşil tendonunu kesin ve kası farenin gövdesine doğru soyun. Gastroknemius kasını serbest bırakmak için tendonu femur'un lateral ve medial kondillerinden kesin ve tendonları bağlı olan gastroknemius kasını soğutulmuş PBS ile dolu bir kaba yerleştirin.

Gastroknemius kasını ters çevirin ve soleus kasını soyarak ayırın. Soleus kasını, beş mililitre soğutulmuş mitokondri izolasyon tamponu içeren behere yerleştirin.

Bir sonraki aşamada gastroknemius kası açıldı ve üç adet görsel olarak kırmızı kas parçası çıkarıldı. İki lateral parça ve bir medial yüzeysel kırmızı şerit olacaktır. İzole edilen kırmızı kas, beş mililitre soğutulmuş mitokondri içeren behere aktarılır.

İzolasyon tamponu bir. Farenin diğer bacağından 75 ila 100 miligram daha kırmızı kas çıkarın. Az önce gösterilen işlemi tekrarlayın.

Diseke edilmiş ikinci bacak kasını, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde hazırlanan proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile hücre lizis tamponu içeren 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne yerleştirin. Western blotting işleminde kullanmak üzere, ikinci örneği hemen sıvı azot içinde şok dondurun. Geniş bir kova içindeki buzun üzerine önceden ısıtılmış düz plastik bir yüzey yerleştirin.

Ardından plastik yüzeye bir damla mitokondri izolasyon tamponu bir dökün ve cımbız kullanarak kesilmiş kırmızı kasın tamamını izolasyon tamponu damlasının içine yerleştirin. Tek kenarlı jiletler kullanarak kas dokusunu iki dakika boyunca incece doğrayın ve her 40 saniyede bir yeni, keskin bir jiletle değiştirin. Doğranmış dokuyu, beş mililitre taze mitokondri içeren yeni bir behere aktarın.

İzolasyon tamponu bir. Ardından çözeltiyi alın ve 50 mililitrelik konik tüp üzerine yerleştirilmiş 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Dokuyu hassas bir temizleme beziyle kurulayın ve ardından beş mililitrelik %0,05 tryin çözeltisine aktarın.

Kalan tüm dokuları cımbız yardımıyla temizleme bezinden alıp tripsin içerisine ekleyin. Kas dokusunu, buz üzerinde tripsin çözeltisi içinde 30 dakika inkübe edin. Ardından numuneyi 4 °C'de, 200 ×g hızında üç dakika boyunca santrifüjleyin.

Santrifüjasyonun ardından, tripsin süpernatantını bir atık kabına dökün ve peleti üç mililitre buz gibi soğuk mitokondri izolasyon tamponu bir ile yeniden süspande edin. Ardından dokuyu 45 mililitrelik bir cam homojenizatör tüpüne aktarın. Kalan tüm numuneyi toplamak için 15 mililitrelik konik tüpü başka bir 1,5 mililitre mitokondri izolasyon tamponu bir ile durulayın ve bunu cam homojenizatör tüpüne ekleyin.

Ardından, cam homogenizatör tüpünü yarıya kadar buzla doldurulmuş bir behere veya plastik kaba yerleştirin. Böylece cam homogenizatör beher içinde minimum düzeyde hareket eder. Numuneyi, motorlu bir doku parçalayıcıya bağlı politetrafloroetilen havanla homogenize edin.

80 RPM'de 10 kez homogenizatörle homojenleştirin. Her geçişin sonunda alt kısmı yaklaşık iki saniye boyunca tutun. Ardından doku homojenatını yeni bir 15 mililitre konik tüpe aktarın.

Cam homojenizatör tüpünü 6,5 milliliters mitochondria isolation buffer one ile durulayın. Tamponu, dokunun geri kalanının bulunduğu 15 milliliters konik tüpe dökün. Homojenize edin. Örneği 4 °C'de 10 dakika boyunca 700 ×g hızında santrifüjleyin ve ardından süpernatantı nazikçe yüksek dayanımlı cam santrifüj tüpüne aktarıp peleti atın.

Ardından, süpernatantı 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüjleyin. Mitokondrileri çöktürmek için süpernatantı uzaklaştırın ve 500 µL mitokondri izolasyon tamponu iki yavaşça ekleyerek peleti yeniden süspande edin; bir pipet ucunun ucunu kesin ve karıştırma ve çalkalama hareketleriyle peleti tampon içerisinde nazikçe homojenize edin. Daha sonra 4,5 mL daha mitokondri izolasyon tamponu ekleyin.

Karışıma Tampon iki ekleyin. Pelet tamamen süspande olduktan sonra, mitokondriyaları yeniden peletlemek için homogenatı 4 °C'de 10 dakika boyunca 8,000 ×g'de santrifüjleyin. Üst fazı uzaklaştırın ve ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak 25 µL'lik artışlarla toplam 2 kez mitokondri izolasyon Tampon iki ekleyerek peleti nazikçe ancak tamamen resüspande edin; her 25 µL tampon eklemesinden sonra peleti nazikçe karıştırın ve karıştırın.

İşlem tamamlandığında, bu mitokondri stokunu buza yerleştirin. Mitokondri stokunun yüksek saflıktaki su ile iki ayrı 1/20 seyreltmesini hazırlayın. Örneklerden birine %0,1 Triton 100 x ekleyin ve düşük ayarda 10 saniye boyunca sonikasyon uygulayın.

Diğer dilüsynu buz üzerinde bırakın ve sonikasyon işlemine tabi tutulan örneği tekrar buza yerleştirin. Sonikasyondan sonra, hem sonike edilmemiş hem de sonike edilmiş mitokondriyal dilüsyonlarla, standart teknikler kullanılarak fotometrik bir analizle sitrat sentaz testi gerçekleştirin; beraberindeki metin protokolünde verilen denklemleri kullanarak sağlam mitokondri membranlarının yüzdesini belirleyin. Mitokondrilerin sonike edilmesi, sitrat sentaz aktivitesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artışla sonuçlanır.

Sonikasyon uygulanmamış mitokondriyal örneklerdeki sitrat sentaz aktivitesinin sonike edilmiş örneklerle karşılaştırılması, izolasyon sonrası mitokondrilerin %92,5'inin sağlam olduğunu göstermektedir. GA DH ve COX 4 ekspresyonu tüm doku lizatında belirginken, izole edilmiş mitokondrilerde COX 4 ekspresyonu gözlenmektedir. GA DH'nin yalnızca sönük bantları görülürken, bu bulgular izolasyon prosedürü sırasında mitokondriyal olmayan bileşenlerden çok az kontaminasyon olduğunu ve başarılı bir mitokondriyal izolasyon gerçekleştirildiğini göstermektedir.

Bu prosedürü uygularken, mitokondriyal stokun dikkatle taşınması, asla vortekslenmemesi veya prosedür sonrasında şiddetli şekilde karıştırılmaması gerektiğini unutmamak önemlidir. Belirli bir müdahalenin izole mitokondrilerde reaktif oksijen türleri üretimine etki edip etmediği gibi ek soruları yanıtlamak için, reaktif oksijen türleri üretiminin ölçülmesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.