油中水型エマルジョン：疎水性顔料と水溶性クロロフィル結合タンパク質を組み立てるための新しいシステム

この技術の全体的な目標は、水溶性タンパク質の結合部位に水に不溶性クロロフィルを組み込むことを可能にすることです。この方法により、クロロフィルと組換えタンパク質の集合が可能になり、クロロフィル-タンパク質相互作用の厳密な研究が可能になり、新規のクロロフィル-タンパク質複合体を構築するための新たな可能性が開かれます。この技術の主な利点は、タンパク質にタグを付けたり固定したりする必要がないことです。

したがって、スクリーニングアッセイに適しています。その手順を実演するのは、私の研究グループのポスドクであるDominica Bednarczykです。以下のストック溶液を調製する際は、化学フードの下、緑色光の下、または暗闇ですべてのクロロフィル調製ステップを行い、光による損傷を最小限に抑えてください。

顔料を凍結して保管する前に、必ず窒素またはアルゴンを加え、すべての溶剤が分析グレードであることを確認してください。まず、凍結乾燥されたスピルリナプラテンシス細胞またはチラコイド膜にクロロフィルaまたはクロロフィル-aのみを含む他のシアノバクテリア細胞の約5グラムの重量を量り、乳鉢と乳棒を使用して粉砕します。クロロフィル抽出中の重要なステップは、シアノバクテリア細胞が完全に凍結乾燥されていることを確認し、アセトンで数回洗浄することでDEAE-セファロースから水を完全に除去することです。

粉砕した細胞をガラスカラムにロードし、約50〜100ミリリットルの100%アセトンで組織を洗浄してカロチノイドを除去します。洗浄後、溶出したオレンジグリーン画分を廃棄します。実際の色は、シアノバクテリアの培養条件や成長条件によって、オレンジグリーンからグリーンまでさまざまです。

アセトンを100%メタノールと交換し、クロロフィルaを含む緑色の画分を回収します。溶出画分の色が濃い緑色から淡い緑色に変わったら、溶出を停止します。次に、摂氏30度を超えないウォーターバスを備えたロータリーエバポレーターを使用して、抽出物が完全に乾くまでメタノールを蒸発させ、少量のジエチルエーテルを使用して乾燥抽出物からの顔料を完全に溶解し、脱脂綿を通して溶液をろ過します。

顔料が完全に乾くまでジエチルエーテルを蒸発させます。この時点で停止する場合は、乾燥顔料を窒素またはアルゴンの暗所で摂氏20度に保ち、さらに処理します。クロロフィルA製剤を進めるには、乾燥顔料を可能な限り最小の100%アセトンで部分的に溶解し、次いで懸濁液に4ミリリットルのアセトンを加え、フラスコを渦巻いて顔料を完全に溶解する。

パスツールピペットを使用して、100%アセトンで平衡化したDEAE-セファロースカラムにサンプルを静かにロードし、100%アセトンでカロチノイドを溶出します。次に、3:1の体積間アセトン-メタノール混合物を使用して、クロロフィルaを溶出します。溶出中に懐中電灯を使用してカラムを短時間照らし、実際の顔料の色を観察することができます。

薄層クロマトグラフィーでは、ジクロロメタンとヘキサン、イソプロパノール、メタノールの体積対体積比が 68:25:5:2 でクロロフィル a の純度を確認し、サンプルを溶出します。次に、ロータリーエバポレーターを使用して、クロロフィルaが完全に乾くまで溶媒を蒸発させます。クロロフィルを調製するには、ストック溶液を乾燥クロロフィルaを100%メタノールの2〜4ミリリットルに再溶解します。

エマルジョンの有機相を調製するために、50ミリリットルのチューブに0.2グラムのTween 80、1.8グラムのSpan 80、および38グラムの鉱油を秤量します。成分をよく混ぜ、溶液を氷の上に置いて冷まします。精製水溶性クロロフィル結合タンパク質(WSCP)を含む水相を調製するには、WSCP遺伝子を含む大腸菌BL21細菌をLB培地1リットル中、摂氏37度でOD600を0.3〜0.6まで増殖させます。

1ミリモルのIPTGを添加してタンパク質発現を誘導し、30°Cで12〜16時間細菌を増殖させた後、5000Gおよび4°Cで10分間遠心分離して細菌を回収します。アフィニティークロマトグラフィーに適した緩衝液を用いてペレットを溶解し、細菌懸濁液を小さなチューブに移し、氷上で超音波処理します。ライセートをスピンダウンした後、メーカーの指示に従って、タンパク質精製用の適切な市販のアフィニティークロマトグラフィーシステムを使用して、組換えタグ付きWSCPタンパク質を精製します。

緩衝液をpH7.8の50ミリモルリン酸緩衝液に交換し、精製したWSCP濃度を1ミリリットルあたり0.5〜1ミリグラムに調整することにより、エマルジョンの水相を調製します。粗細菌溶解物をWSCPで含んだ水相を調製するには、WSCPを発現するプラスミドを含む大腸菌BL21細胞をLB250ミリリットルで37°Cで増殖させ、log相にします。1ミリモルのIPTGを添加してタンパク質の発現を誘導し、摂氏30度で一晩で細菌を増殖させます。

翌日、細菌細胞を収穫した後、1〜2ミリリットルの50ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液pH7.8を使用してペレットを溶解します。次に、超音波処理後、溶解物を12, 000Gおよび摂氏4度で30分間遠心分離する。0.125ミリリットルの上清と0.875ミリリットルの50ミリモルリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.8を混合することにより、エマルジョンの水相を調製します。

エマルジョン中のクロロフィルaとWSCPを組み立てるには、十分に混合した油-界面活性剤混合物の5ミリリットルをガラスバイアルに移し、氷上で冷却します。調製したばかりの氷冷水相を1ミリリットル加え、氷上で9,500RPMの組織ホモジナイザーを2分間使用して、両方の相を混合します。この時点から、光による損傷を最小限に抑えるために緑色の光の下ですべてのステップを実行し、エマルジョンにストック溶液である25ミリモルクロロフィルの20マイクロリットルを追加します。

ガラスバイアルをはじいたり反転させたりして分散させ、クロロフィルaがエマルジョン中に均一に分布するようにしてから、暗闇の中で氷上で1〜2時間インキュベートします。エマルジョン調製中の重要なステップは、混合する前に水相と有機相の両方を冷却することです。次に、エマルジョンを分解し、有機相から水滴を分離するために、エマルジョンを1.5ミリリットルのプラスチックチューブに移し、室温で14, 000Gで5分間遠心分離します。

上油相を廃棄し、下相に1ミリリットルの鉱物油を加え、ボルテックスまたはチューブを反転させてよく混合します。サンプルを回転させた後、上部油相を除去し、中間エマルジョンなしで水相と鉱物油相を分離する透明なメニスカスが得られるまで、鉱物油の添加と遠心分離を繰り返します。次に、水相に1ミリリットルの水飽和ジエチルエーテルを加えます。

次に、サンプルをボルテックスした後、室温で5分間14, 000Gでスピンダウンします。3回目の遠心分離後、フード内でジエチルエーテルを取り出し、チューブを5〜20分間開いたままにします。最後に、WSCP-クロロフィルA複合体を含む水相を脱塩カラムにロードし、将来の実験に適したバッファーで溶出します。

サンプルは、光から4°C離れた場所に最大1か月間保管してください。このビデオで説明されているプロトコルを使用して、組換えWSCPアポタンパク質を水および油エマルジョン中のクロロフィルaとアセンブルしました。ここに示されているのは、4つの組換えWSCPバリアントを持つクロロフィルA複合体の吸光度とCDスペクトルです。

結果は、バンド状の端点が、それぞれの天然複合体の以前に報告されたスペクトルと類似しています。この図は、水相の緑色から見られるように、WSCP発現細胞のライセート中のWSCPとクロロフィルaとの正の集合を示しています。この結果は、水および油エマルジョンが、クロロフィルによるWSCPのポジティブアセンブリの高速スクリーニングシステムとしての可能性を示しています。

ここで示したように、WSCP含有ライセートの液滴は、共焦点顕微鏡画像で明確なクロロフィルa蛍光を特徴としています。これは、WSCP-クロロフィル複合体の正常な集合が水滴で直接検出できることを意味し、水および油エマルジョンベースのスクリーニングシステムの基礎を提供する可能性があります。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば5時間行うことができます。

この手順を試みる際には、クロロフィルの使用は、クロロフィルを光や酸素にさらすことなく迅速に行う必要があることを覚えておくことが重要です。開発後、この技術により、タンパク質環境がクロロフィルの電解特性やスペクトル特性に及ぼす影響を調べるために、さまざまな水溶性クロロフィル結合タンパク質を調製することができました。このビデオを見た後、シアノバクテリアからクロロフィルを抽出して精製し、水と油のエマルジョンを使用して水溶性タンパク質に組み立てる方法をよく理解しているはずです。

エーテル、メタノール、アセトンなどの有機溶剤での作業は有害である可能性があるため、この手順を実行するときは、化学フードでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。