Laterale Root inducibile di sistema in Arabidopsis E mais

L'obiettivo generale del sistema inducibile dalle radici laterali è quello di indurre in modo sincrono l'inizio delle radici laterali nelle piante utilizzando trattamenti ormonali. Le radici delle piante sono nascoste e sono note per essere estremamente difficili da studiare. Abbiamo sviluppato un sistema in vitro che permette di studiare il processo di iniziazione della radice laterale a livello citologico, istologico e molecolare.

In generale, gli scienziati che non conoscono questo metodo potrebbero avere difficoltà perché le piante non sono cresciute in un contatto corretto con il substrato, impedendo un'induzione omogenea delle radici laterali. La dimostrazione visiva di questo metodo aiuta a mostrare i passaggi critici che dovrebbero essere presi in considerazione per garantire un'induzione omogenea. Sebbene questo sistema sia stato originariamente sviluppato in una piccola pianta di Arabidopsis, può essere applicato anche ad altri sistemi come mais, riso o orzo.

Per iniziare, applica una rete di nylon da 20 micron al terreno di crescita integrato con NPA utilizzando un paio di pinzette sterili. Spingi delicatamente la rete sul terreno di coltura usando un drigalski per assicurarti che sia in buon contatto con il terreno. Quindi, pizzica uno stuzzicadenti sterile nell'agar per creare una superficie appiccicosa sullo stuzzicadenti.

Usa lo stuzzicadenti per distribuire uniformemente un lotto di semi sterilizzati a gas sui piatti preparati. Sigillare le piastre con nastro adesivo traspirante e conservarle a quattro gradi Celsius al buio per almeno due giorni e un massimo di una settimana. Questo è necessario per la stratificazione e garantisce una germinazione sincronizzata ed efficiente.

Il terzo giorno, sposta le piastre nella stanza di crescita per due giorni di germinazione seguiti da tre giorni di crescita con un angolo compreso tra 80 e 90 gradi. L'ottavo giorno, identifica le radici che sono cresciute interamente a contatto con la rete e, al contrario, le radici che non sono a contatto con la rete. Rimuovere tutte le piantine le cui radici non sono a contatto con la rete.

Trasferire le reti contenenti piantine in piastre integrate con 10 micromolari di NAA. Una volta sulla piastra, se necessario, scremare la rete sulla superficie del terreno di coltura per assicurarsi che sia in buon contatto con il terreno di coltura. Per garantire un'induzione omogenea in tutte le piantine, è importante scartare le piantine che non sono cresciute a contatto con la rete su terreno integrato con NPA e schiumare correttamente la rete, se necessario, su terreno integrato con NAA.

Sigillare le nuove piastre con nastro traspirante e posizionarle nella stanza di crescita in posizione verticale per il periodo di tempo desiderato dopo l'induzione. Quando sei pronto per raccogliere i campioni, usa un bisturi per tagliare i segmenti di radice tutti in una volta direttamente sulla rete e campionali raschiando delicatamente la superficie della rete. Mostreremo ora alcuni passaggi del sistema di induzione delle radici laterali nel mais.

Iniziare sterilizzando i chicchi di mais inserendo prima il numero necessario di chicchi in un becher di vetro sterile. Quindi, aggiungere 100 millilitri di ipoclorito di sodio al 6% in acqua al becher e aggiungere un'ancoretta magnetica. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e mescolare a bassa velocità per cinque minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere delicatamente la soluzione di candeggina. Sostituirlo con 100 millilitri di acqua fresca sterile e sciacquare i chicchi per cinque minuti. Ripeti questo passaggio cinque volte.

Indossa un paio di guanti e strappa due pezzi di carta assorbente, posizionandoli uno sopra l'altro su una superficie pulita. Quindi, piegare le sfoglie a metà sulla lunghezza. Usa le pinzette per distribuire 10 chicchi a circa due centimetri dall'alto, su tutta la lunghezza della carta mantenendo una distanza intercapedine di otto centimetri tra ogni chicco e otto centimetri liberi ad entrambe le estremità.

Assicurati che il radicale del chicco sia rivolto verso il basso e verso la carta. Arrotolare delicatamente la carta per tutta la lunghezza mantenendo i semi in posizione. Spruzzare la carta con acqua sterile può facilitare questo passaggio, se necessario.

Mettere i rotoli in provette di vetro sterilizzate e unire altre provette nella griglia. Versare 125 millilitri di una soluzione NPA da 50 micromolari sul rotolo di carta nel tubo. Il rotolo di carta assorbirà la soluzione e si impregnerà completamente.

Posizionare il sistema di rotoli di carta in un armadio di crescita per tre giorni. Assicurarsi che i rotoli di carta rimangano inzuppati durante l'incubazione aggiungendo altra soluzione di NPA se necessario. Per garantire un'induzione omogenea dell'inizio laterale della radice, è importante controllare che i rotoli di carta rimangano idratati nella soluzione di NPA, ma che le radici non siano immerse nel liquido stesso.

Dopo tre giorni di NPA, la piantina di mais ha un piccolo germoglio e una radice di circa due o tre centimetri. Il quarto giorno, spremere delicatamente la maggior parte della soluzione di NPA rimanente dai rotoli di carta e immergerli in acqua sterile fino a quando non diventano saturi. Dopo circa cinque minuti, spremere delicatamente la maggior parte dell'acqua dai rotoli di carta.

Ripetere la fase di lavaggio tre volte. Dopo l'ultimo risciacquo, spremere la maggior parte dell'acqua e rimetterla nel tubo. Versare una soluzione 50 micromolare di NAA sui rotoli di carta nelle provette fino a quando non si inzuppano completamente.

Quindi, posizionare il sistema di rotoli di carta nella camera di crescita per la durata desiderata dopo l'induzione. Rispetto alle piantine della linea del marcatore di risposta dei buoi pDR5-GUS che non sono cresciute su NAA o sono cresciute per un'ora su NAA, le piantine cresciute per due ore su NAA mostrano una risposta dei buoi che è uno dei primi eventi che innescano l'inizio laterale delle radici. Queste divisioni iniziano a salire dalla punta a partire da circa due ore e aumentano con l'esposizione prolungata al NAA.

Utilizzando la linea di marcatura del ciclo cellulare pCYCB1; 1-Gus, le prime divisioni cellulari che portano alla formazione delle radici laterali possono essere osservate a partire da circa sei ore dopo l'inizio del trattamento con NAA. I microarray e la rt-PCR quantitativa possono essere utilizzati per valutare l'espressione di vari geni nelle diverse regioni dell'Arabidopsis e delle radici di mais durante l'induzione laterale delle radici. Sia nell'arabidposi che nel mais, quando le piante crescono più a lungo, le divisioni indotte daranno origine allo sviluppo e alla crescita delle radici laterali.

Come prova di concetto per il sistema sul mais, ecco le piantine coltivate in diverse condizioni per il confronto. Le piantine coltivate per 10 giorni sull'acqua hanno radici laterali che non si sono avviate in modo sincrono e sono ampiamente distanziate lungo l'asse. Le piantine coltivate per 10 giorni su NPA non contengono affatto radici laterali.

Le piantine coltivate per tre giorni su NPA, seguite da un trattamento NAA, mostrano un'induzione massiccia e sincronizzata delle radici laterali. In questo video vi abbiamo mostrato come impostare un sistema inducibile dalla radice laterale che si è rivelato molto essenziale nella scoperta di nuove intuizioni fondamentali nel processo di ramificazione delle radici. Vi abbiamo mostrato come funziona per l'Arabidopsis e il mais, ma può essere facilmente adattato ad altre specie vegetali di scelta.

Buona Fortuna.