Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

O objetivo geral da tecnologia de conversão de fotos PSmOrange é rastrear células no animal vivo durante o desenvolvimento embrionário e a doença. Este método pode responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como descobrir a origem das células que se desenvolvem em tecidos e órgãos. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser aplicada em fundos transgênicos GFP.

Este método também pode ser aplicado em diferentes campos de investigação, como regeneração, progressão tumoral e invasão. Depois de gerar e incorporar embriões que expressam PSmOrange e GFP de acordo com o protocolo de texto, coloque o embrião sob o microscópio confocal e use a objetiva de ar 20x e os lasers de 488 e 561 nanômetros para escanear a amostra para identificar uma área para fotoconverter. Para detectar a proteína PSmOrange antes da fotoconversão, use o laser de 561 nanômetros a 0,74 miliwatts de potência medida no plano de foco acima da objetiva e ajuste a potência do laser conforme necessário.

Ajuste os fatores de zoom para destacar a área de interesse e reduzir o tempo de aquisição da imagem e a toxicidade da foto. Usando os lasers de 488 e 561 nanômetros em modo sequencial e um passo Z entre 1,0 e 2,0 micrômetros, adquira uma pilha Z cobrindo as estruturas de interesse. Ajuste a média da linha e a frequência de varredura para otimizar a qualidade da imagem.

Em seguida, digitalize a amostra e selecione a região de interesse, ou ferramenta ROI, para destacar a área a ser fotoconvertida antes de fixar o ROI como a área de estimulação. Selecione o módulo de branqueamento de fotoativação, marque a caixa para ativar o laser de 488 nanômetros e, em seguida, defina o laser de 488 nanômetros para 80% e a velocidade de varredura para 0,5 segundos por quadro. Em seguida, abra o utilitário de fotoconversão e clique em Adicionar'para especificar o protocolo de fotoconversão.

No menu de estimulação de aquisição, defina a Fase Um para aquisição e, no menu de loops, indique o número de imagens a serem adquiridas antes da fotoconversão. Defina a Fase Dois para estimulação e insira o número de eventos de estimulação a serem realizados. Ajuste a Fase Três conforme descrito para a Fase Um.

Opcionalmente, insira uma Fase de espera após a Fase Dois, inserindo o tempo de espera antes da última rodada de aquisição de imagem. Uma vez que os parâmetros estejam definidos, aplique a configuração de estimulação e execute a fotoconversão. Configurações miscroscópicas são cruciais para a fotoconversão do PSmOrange.

Para garantir uma fotoconversão bem-sucedida, o embrião é fotografado diretamente após o experimento para detectar a proteína PSmOrange fotoconvertida. Se a conversão não for bem-sucedida, o procedimento será repetido. Usando os lasers de 488, 561 e 640 nanômetros e configurando o laser de 640 nanômetros para alta potência, até 4,5 miliwatts, adquira uma pilha z final com as configurações que acabamos de descrever.

Para desmontar o embrião, remova a câmara do microscópio e use uma pinça para remover o embrião da agarose. Transfira o embrião para uma nova placa de Petri de plástico esterilizada ou placa esterilizada de 6 poços, contendo PTU de 0,2 milimolar em E3. Incubar o embrião a 28 graus Celsius até o estágio desejado de desenvolvimento. Para analisar o destino das células que expressam a proteína PSmOrange fotoconvertida, reincorpore o embrião de acordo com o protocolo de texto.

Sob o miscroscópio confocal, escaneie a amostra para identificar células fotoconvertidas na estrutura transgênica GFP de interesse. Use os lasers de 488, 561 e 640 nanômetros para adquirir uma pilha z com uma pilha fixa de 1 a 2 micrômetros no modo sequencial cobrindo as estruturas. Usando o software Image J Fiji, identifique as células que co-expressam GFP e a proteína fotoconvertida.

Duplique a pilha original, use o plugin Gaussian Blur e a calculadora de imagens para subtrair as pilhas suaves do original. Aplique limites específicos aos canais verde e vermelho distante para destacar as células fotoconvertidas. Em seguida, use a ferramenta Analisar partículas para detectar as áreas de limite no canal verde com uma configuração adequada.

Repita esta etapa para o canal vermelho distante. Abra o plug-in da calculadora de imagens para detectar as células de colocalização. Exiba em amarelo os ROIs sobrepostos no canal verde ou vermelho distante usando a ferramenta Analisar partículas.

Usando o software NIS-Elements, realize a avaliação de data 3D e exiba a pilha em 3D usando a opção Mostrar visualização de volume. Em seguida, use a interface gráfica para selecionar os canais verde, vermelho e vermelho distante, ajuste o brilho e o contraste e corte a pilha 3D para destacar a área fotoconvertida. Aqui é mostrado um exemplo do sistema de fotocoversão PSmOrange em embriões GFP de cabeça flutuante FOXD3 transgênicos de peixe-zebra.

Às 26 horas após a fertilização, dois aglomerados de células na parte anterior da pineal foram fotoconvertidos e imediatamente fotografados. A proteína foi detectada com um laser vermelho distante de 640 nanômetros, mas não com um laser de 561 nanômetros. Nessas células, a expressão de GFP foi inicialmente reduzida devido ao fotobranqueamento.

Aos 52 HPF, GFP e H2B PSmOrange foram detectados nas células fotoconvertidas que expressam a proteína H2B PSmOrange. Algumas dessas células formaram o parapineal no lado esquerdo do cérebro. Este resultado é consistente com relatos anteriores sobre a origem das células parapineais na pineal anterior e mostra a aplicabilidade da técnica PSmOrange no embrião vivo de vertebrados transgênicos GFP.

Após este procedimento, a análise de rastreamento celular pode ser realizada em embriões geneticamente manipulados para responder a perguntas adicionais sobre as hierarquias moleculares subjacentes ao desenvolvimento da célula.