תלת ממד תרבות אלגינט חרוז של תאי אדנומה יותרת המוח האנושי

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לתאר תרבית חרוזי אלגינט תלת מימדית לשמירה על תאי אדנומה של יותרת המוח האנושית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי הגידול, כגון ביטוי של סמנים שונים של פולשניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפיגום אלגינט, בניגוד למערכות תלת מימדיות אחרות, מאפשר לתאי אדנומה של יותרת המוח להשתפר מחרוזי האלגינט לצורך חקירה נוספת.

תדגים את ההליך כרמן סולאנו-אגמה, עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תוך כדי עבודה בתוך ארון זרימה למינרית, הניחו רקמת גידול אדנומה שהושגה בעבר בצלחת של 35 מילימטר, המכילה כ -20 מיליליטר PBS ללא סידן ומגנזיום. בעזרת פינצטה כירורגית, העבירו את הרקמה לצלחת פטרי אחרת המכילה PBS טרי כדי לשטוף את הרקמה.

חזור על ההעברה למאגר טרי עד להסרת כדוריות הדם האדומות והפסולת. לאחר מכן, בעזרת הפינצטה הכירורגית, החזיקו את רקמת האדנומה של יותרת המוח, ובעזרת מספריים כירורגיים קטנים, חתכו את הרקמה לחתיכות קטנות. לאחר מכן, בעזרת פיפטת פסטר עם קצוות מעוגלים, העבירו את שברי הרקמה והחוצץ לתוך צינור של 15 מיליליטר.

צנטריפוגה בטמפרטורה של 68 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הסיבוב, השתמש בפיפטה פסטר כדי להסיר את ה-PBS, והוסף שלושה עד חמישה מיליליטר תמיסת קולגנאז. מערבבים פעמיים-שלוש על ידי היפוך הצינור, ודוגרים על הרקמה בקולגנאז ב-37 מעלות צלזיוס בסיבוב קבוע למשך 30 דקות.

צנטריפוגה שוב את הצינור למשך 10 דקות, והשתמש בפיפטה של פסטר כדי להסיר את תמיסת הקולגנאז. מוסיפים 5 מיליליטר TNase, ומערבבים פעמיים-שלוש על ידי היפוך, ואז צנטריפוגה שוב את הדגימה. אם הרקמה אינה מנותקת לחלוטין, בצע עיכול אנזימטי שני על פי פרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנט והשליכו אותו. לאחר מכן השתמש בנפח אחד של תמיסת EGTA כדי להשהות מחדש את הגלולה, וערבב בעדינות עם שני נפחים של תמיסת אלגינט. הסר את הבוכנה ממזרק סטרילי המכיל מחט בקוטר 21, והשתמש בפיפטה כדי להעמיס את האלגינט ואת קולוציה התאים לתוך המזרק.

הכנס בעדינות את הבוכנה למזרק, והניח את מחט המזרק בכוס, כחמישה סנטימטרים מתמיסת הסידן הכלורי. כעת, הוצא בזהירות את תרחיף תאי האלגינט טיפה אחר טיפה לתוך הכוס. המתלה יג'ל במגע עם התמיסה ליצירת חרוזים כדוריים.

בעזרת תנועות סיבוביות, מערבבים לאט את הזכוכית כדי למנוע מהחרוזים להידבק. לאחר מכן שמור את חרוזי האלגינט בתמיסת הסידן הכלורי למשך חמש דקות. לאחר הדגירה, הסר בזהירות את תמיסת הסידן, והשתמש בשלושה עד חמישה מיליליטר M199 מועשר ב-20% FBS כדי לשטוף את החרוזים פעמיים.

בעזרת מרית סטרילית, העבירו את חרוזי האלגינט לבקבוק תרבית רקמה T25 רגיל, והוסיפו ארבעה עד חמישה מיליליטר M199 עם FBS. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח. לאחר הכנת כיסויים מצופים פולי-D-lycine, על פי פרוטוקול הטקסט.

כדי לנתח את השלד הציטולוגי של אקטין, השתמש בפיפטה כדי להעביר מיליליטר אחד של חרוזי אלגינט מבקבוק התרבות לתוך צינור של 15 מיליליטר. הוסף חמישה מיליליטר של נתרן ציטראט 55 מילימולר, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 68 פעמים גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. ואז שאפו את הסופרנטנט, והשליכו.

באמצעות מיליליטר אחד של M199 חם מועשר ב-20% FBS, אנו משעים את הגלולה ומערבבים בעדינות את תרחיף התאים. לאחר מכן, לאחר ספירת התאים על פי פרוטוקול הטקסט, זרעו 35,000 תאים על כיסויי זכוכית מצופים פולי-D-lycine בקוטר 13 מיליליטר. לאחר דגירה של התאים במשך 48 שעות, הסר את מדיום התרבית והשתמש ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעם אחת.

לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר לכל כיסוי של מאגר קיבוע כדי לתקן ולחלחל את התאים, ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר את מאגר הקיבוע והוסף 500 מיקרוליטר לכל כיסוי של 3.5% פרפורמלדהיד ב-PBS. לאחר מכן דגרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הסרת התמיסה.

לבסוף, לאחר שטיפת התאים והדגירה בתמיסת פלואידין מצומד רודמין ודאפי, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם אורך גל סובייקטיבי פי 63 ועירור 541 כדי לרכוש תמונות של שלד הציטו של האקטין. איור זה מציג תאי אדנומה יותרת המוח משובצים בחרוזי אלגינט לאחר שלושה חודשים. כפי שמוצג כאן, התאים מציגים צורות מעוגלות דו-שבירות תחת מיקרוסקופ אור הפוך.

באיור זה ניתן לראות את הלוקליזציה של N-cadherin בתאי אדנומה של יותרת המוח של חולדות המוטבעות באלגינט. ה-N-cadherin ממוקם במגעים בין תאים והגרעין מציג את הכרומטין מורחב. בניסוי זה, מדד ההתפשטות התקבל מ-10 אדנומות של יותרת המוח האנושיות שאינן מתפקדות, תוך שימוש בתגובתיות החיסונית של Ki67, והתקבל מדד תיוג ממוצע של 19.2 פלוס מינוס 1.5%.

כאן, השלד הציטולוגי של תאים לא פולשניים הציג צורות מוארכות עם סיבי עקה קטנים של אקטין. ככל שיותר פולאז'ים וסידורי חוטי אקטין השתנו עם אדנומת יותרת המוח ללא תלות במערכת התרבית. לדוגמה, באדנומה פולשנית שאינה מתפקדת, הצורה השולטת בין תאים אלה הייתה מעוגלת, עם טבעות קליפת המוח הלא רציפות של חוטי אקטין.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את תרבית אדנומת יותרת המוח העיקרית תוך שלוש שעות. ניתן לבצע אנקפסולציה של אלגינט תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על המחט לא יותר מחמישה סנטימטרים מתמיסת הסידן כדי למנוע את הפנינים המוצקות והתאים המתים עקב התנגשות הזרם של תמיסת תאי האלגינט עם פני השטח של תמיסת הסידן.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו קיבוע של סיביות האלגינט, ולאחר מכן התייבשות עם פוליאתילן גליקול על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כיצד תאי אדנומה של יותרת המוח מארגנים את השלד הציטולוגי שלהם בפיגום תלת מימדי זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשמור על תאי אדנומה של יותרת המוח בתרבית חרוזי אלגינט תלת מימדית.