Loss- ونهج كسب من وظيفة إلى التحقيق في خلية المبكر مصير محددات في سابق للانغراس أجنة الفئران

الهدف العام من هذا البروتوكول هو استخدام التلاعب بفقدان واكتساب الوظيفة لتحديد الجزيئات الخاصة بالمرحلة التي تتحكم في تمايز كتلة الخلية الداخلية لأجنة الفئران أثناء ما قبل الزرع. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي المتعلق بتحرير مصير الخلية المبكر في علم الأحياء التنموي الأساسي ، وكذلك في بيولوجيا الخلايا الجذعية ، وعلوم ، والتكنولوجيا الحيوية الإنجابية ، مثل استنساخ. الهدف الرئيسي من هذه التقنية هو أن المستقبل الخاص بالمرحلة ، وهناك روابط تستخدم لتعزيز التعبير عن عامل خاص بالخلايا الجذعية الجنينية فقط أثناء نمو الجنين.

تم تطوير هذا البروتوكول بالتعاون مع مختبرات متعددة. لذا فإن إظهار العملية سيكون تعاوني ، البروفيسور سانغ جين لي ، وطالب الدراسات العليا ، يونغ إيل تشو. بعد 18 إلى 20 ساعة من الحقنة الأخيرة ، قم بالتضحية بالإناث الحوامل عن طريق التسمم بثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم.

ثم افتح الجزء الخلفي ، واقطع الطبقة الداخلية بمقص ناعم. ابحث عن قرون الرحم والتقطها باستخدام ملقط دقيق ، واسحبها برفق من تجويف الجسم ، جنبا إلى جنب مع الرحم وقناة البيض والمبيض والوسادات الدهنية. بعد ذلك ، قم بقص المنطقة الواقعة بين قناة البيض والمبيض باستخدام مقص ناعم.

بعد ذلك ، أعد وضع الملقط وقطع الرحم بالقرب من قناة البيض ، مع ترك سنتيمترا واحدا على الأقل من الجزء العلوي من الرحم متصلا. الآن ، انقل الأمبولة المبيضية إلى قطرة الوسائط M16 المغطاة بالزيت المعدني على طبق بتري 35 ملم في درجة حرارة الغرفة. تجمع قنوات البيض من عدة فئران في نفس الطبق.

بعد تحضير إبرة حقنة CC ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، استخدم ملقطا دقيقا لتثبيت نهاية قناة البيض وإدخالها. ثم ثقب برفق والضغط على الكتلة الركامية في مرحلة إسقاط الوسائط. تحت المجهر المجسم ، استرجع أجنة 2-PN جنبا إلى جنب مع الكتل الركامية المحيطة ، باستخدام ماصة زجاجية معقمة ، وانقلها إلى طبق بتري جديد.

بعد ذلك ، قم بفصل الخلايا الركامية عن طريق استحمام الأنسجة في مليلتر واحد من محلول الهيالورونيداز. الآن ، احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق. الخطوة التالية هي تجريد الأجنة.

باستخدام الماصة الزجاجية ، قم بتدفق محلول الاستحمام برفق لتحرير الخلايا الركامية من الأجنة المحيطة. بعد ذلك ، اغسل الأجنة المجردة من 30 إلى 50 مل من PBS الطازج لكل جنين. قم بإجراء هذا الغسيل ثلاث مرات.

الآن ، انقل الأجنة إلى طبق بلاستيكي 35 ملم مع M16 بالإضافة إلى BSA ، واحتفظ بها في حاضنة رطبة لمدة تصل إلى أربع ساعات قبل الحقن المجهري. قبل الحقن المجهري ، اغسل لفترة وجيزة أجنة 2-PN المجردة بمليلتر واحد من M16 الطازج. بعد ذلك ، انقل الأجنة في محلول إلى أنبوب طرد مركزي ، وقم بتدويرها عند 1000 جي لمدة 10 دقائق.

الآن ، انقل كل جنين إلى طبق استزراع يحتوي على 20 إلى 30 ميكرولترا من وسائط M16. هذا سيجعل النوى مرئية. قم بتغطية الوسائط بطبقة رقيقة من الزيت المعدني ، واحتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة إلى ساعتين.

وفي الوقت نفسه، باستخدام مجتذب ميكانيكي، قم بإعداد ماصات الحقن وتثبيت الماصات من الأنابيب الشعرية الزجاجية البورسيليكا. بعد ذلك، باستخدام مطحنة دقيقة ومزور دقيق، قم بتصنيع ماصات الحقن بأطراف غير حادة، وقم بتلميعها في فتحتين بعرض ميكرون. يجب أن يكون طول الطرف أقل من 500 ميكرون.

وبالمثل ، قم بتصنيع ماصات تثبيت عن طريق عمل أطراف غير حادة وتلميع فتحاتها بقطر داخلي يبلغ 20 ميكرون ، وقطر خارجي يبلغ 100 ميكرون. الآن ، قم بتحميل ماصات الحقن بما لا يقل عن 200 نانولتر من محلول البلازميد بتركيز ميكروغرام واحد من الحمض النووي لكل ميكرولتر. بعد ذلك، قم بتركيب ماصة الحقن في مناور دقيق آلي.

بعد ذلك ، اضبط الحاقن على نبض بحوالي 10 بيكوليتر. بالنسبة للحقن المجهري، قم بتأمين الأجنة باستخدام الضغط السلبي من الماصة القابضة. بعد ذلك، تقدم وضع طرف ماصة الحقن المجاورة لغشاء الخلية فوق إحدى النوى مباشرة.

ثم ، قم بتحريك غشاء الخلية ، وادفع أكثر في النواة ، وقم بعمل حقن 10 بيكوليتر. بعد الحقن المجهري ، اجمع الأجنة المحقونة واغسلها ثلاث مرات بوسائط M16 جديدة. يمكن أن تكون مدة كل غسلة أقل من دقيقة.

بعد ذلك ، تابع زراعة الأجنة عن طريق تغطية وسائط M16 بقطرة من الزيت المعدني لمنعها من التبخر ، ووضع كل جنين على طبق استزراع بلاستيكي على قطرة من وسائط M16. كل 24 ساعة ، راقب الأجنة باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤر مع بصريات DIC 488 نانومتر أو 555 نانومتر بتكبير 200x. يتم التعبير عن النيوجينين بشكل عابر خلال مراحل النمو المبكرة لما قبل الزرع.

يظهر في وقت مبكر من المرحلة المكونة من خليتين ، ويستمر حتى مرحلة المورولا المبكرة. يقتصر تعبيره مكانيا بشكل أساسي على الخارج من الخلايا. تم التلاعب بمستويات تعبير النيوجينين عن طريق الحقن الدقيق للزيجوت 2-PN مع نواقل النيوجينين (كدنا) ، أو النواقل التي تحتوي على الحمض النووي الريبي القصير ضد النيوجينين.

تم التعبير عن طلب تقديم العروض والبرنامج العام العالمي كمؤشرات. تم تأكيد مستوى تعبير النيوجينين الناتج عن طريق التألق المناعي والنشاف المناعي. لم تكن هناك اختلافات مورفولوجية جسيمة في فقدان النيوجينين أو أجنة اكتساب النيوجينين ، ولم تتطور بشكل مختلف حتى مرحلة الكيسة الأريمية.

ومع ذلك ، كان تطور ICM أقل وضوحا في أجنة فقدان النيوجينين ، كما تم قياسه بواسطة خلايا ICM الإيجابية في ثلاثة وأربع أكتوبر. أيضا ، كان هناك المزيد من خلايا ICM الإيجابية في ثلاثة أكتوبر وأربع خلايا ICM لكل كيسة أريمية في أجنة اكتساب النيوجينين. تم تأكيد هذه الملاحظة بشكل أكبر من خلال تحليل rtPCR.

في أجنة اكتساب النيوجينين ، زادت تعبيرات أكتوبر الثالث والرابع ، SOX2 ، و Nanog بشكل كبير ، على عكس تغيير التعبير الضئيل في Cdx2 و Tead4. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال جزء الحقن المجهري هذا من هذا البروتوكول في حوالي ساعة واحدة. أثناء محاولة هذا البروتوكول ، ضع في اعتبارك أن جنين 2-PN عبارة عن مجمدات محسنة للحقن المجهري للعزل يتم زراعة الجنين لتقليل الضرر.

إجراء استكمال هذه الطريقة الإجرائية ، مثل دراسات الأدوية ، للإجابة على سؤال قديم حول مسار الإشارات وما إلى ذلك.