Name: Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprenda a caracterizar defeitos morfogênicos durante o alongamento embrionário em Caenorhabditis elegans usando microscopia de contraste de interferência diferencial. Este método identifica genes reguladores em diferentes fases e regiões do embrião.

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Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia (NSERC) do Canadá e da Fundação Canadense para Inovação. Obrigado ao Dr. Paul Mains (Universidade de Calgary, Calgary, Canadá) pela cepa let-502(sb118ts). Algumas das cepas foram fornecidas pelo Caenorhabditis Genetics Center, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve novas métricas para caracterizar início e fases tardias de alongamento embrionário. Na seção 1, o passo crítico é a potencial presença de bactérias no teclado. Os embriões são hermeticamente fechado entre a almofada e a lamela durante a aquisição de imagem. Selagem a lâmina é necessário para evitar a dessecação dos animais durante a aquisição que dura mais do que duas horas. Para nosso conhecimento, nenhum dos cimentos usados ​​para montar almofadas de agarose entre l...

Por quase 50 anos, os nematóides Caenorhabditis elegans estabeleceu-se como um modelo poderoso para estudar questões importantes no desenvolvimento, neurobiologia, evolução, interações patógeno-hospedeiro, etc. 1 A força deste modelo no estudo do desenvolvimento encontra-se em: seu ciclo de vida curta de 3 dias; a facilidade com que estes animais podem ser geneticamente alteradas; sua transparência que permite a observação de deslocamento e morfologia celular em animais vivos e seu desenvolvimento que é principalmente extra-uterina. As fases de desenvolvimento do nematóide envolvem embriogênese e quatro estágios larvais (L1 a L4), seguido por idade adulta. Durante o desenvolvimento embrionário, epidérmica morfogênese atraiu considerável atenção por sua capacidade de permitir uma melhor compreensão de como epitelial células migram como um grupo, como eles reorganizar suas junções e modificar sua morfologia individual, bem como o seu posicionamento relativo dentro de um epitélio funcional.morfogénese epidérmico é dividido em quatro fases: intercalação dorsal que consiste na reorganização das células epidérmicas dorsal, designado por hipoderme; ventral invólucro, que consiste na migração de células ventrais hipodérmicas para com a linha média ventral, assim, que encerra o embrião de uma monocamada de células epiteliais; início e alongamento final de transformação do embrião em forma de feijão em larvas vermiforme. Seguindo morfogênese, Vigia do embrião e as larvas L1 iniciar a alimentação por meio de bactérias disponíveis no seu ambiente imediato. alongamento embrionário é, por conseguinte, uma fase tardia do desenvolvimento embrionário. Consiste na extensão do embrião ao longo do seu eixo longitudinal e uma redução do seu diâmetro transversal. Isto envolve uma modificação da forma dramática das células hipodérmicas. Alongamento é dividido em um precoce e uma fase tardia. A fase inicial começa na fase vírgula e termina quando os músculos do corpo de parede começam a contrair na fase de 1,75 vezes em wdo tipo DPI (em peso) de embriões - correspondente a embriões que são 1,75 vezes em comprimento em comparação com os embriões não alongado. Morfogênese que ocorrem nessa fase são impulsionadas principalmente pela contração de feixes de filamentos de actina (FBS) localizadas no pólo apical de células hipodérmicas que impulsionam seu alongamento ao longo do eixo antero-posterior do embrião 2. A contração dos corpos estranhos é o controle por fosforilação das cadeias de miosina-luz por três quinases LET-502 / Rock, MRCK-1 e Pak-1 5. A fase final do alongamento, começa quando os músculos do corpo de parede se tornar funcional e começar a contratação. Trata-se de sinalização mecanotransdução dos músculos do corpo de parede para as células dorsal e ventral hipodérmicas e termina quando os animais chocar 3. Alongamento defeitos são geralmente caracterizadas por a percentagem de animais que morrem como embriões (letalidade embrionária; Emb) e aqueles prender o seu desenvolvimento como larvas L1 (fenótipo prisão larval; Lva) e ser significativamente menor do que em peso. A identificação do estágio da prisão de desenvolvimento requer observação microscópica de embriões mortos e presos Larvas 3-6. Recentemente, foi demonstrado que vários genes, tais como o regulador de Cdc42 / Rac efector e pix-1 e Pak-1, o controlo dos processos morfogénicas durante tanto precoce e tardia de alongamento 3,7. Nós também mostrou recentemente que os processos morfogénicas diferem ao longo do eixo ântero-posterior do embrião precoce durante o alongamento 3 7. Estes resultados motivou o desenvolvimento de novas métricas destinadas especificamente às etapas de alongamento precoce ou tardia e outras de medição, permitindo a caracterização da morfologia de embriões ao longo do seu eixo ântero-posterior durante o alongamento inicial. Estes novos métodos consistem na medição do comprimento de embriões no início e no final de alongamento precoce, bem como a largura da sua eleanúncios e caudas. 7 Dois protocolos foram também desenvolvidos para medir o comprimento das larvas recém-nascidas, sincronizados em L1 estágio 7. Os ovos dos embriões protegê-los contra o tratamento alcalino, enquanto hipoclorito larvas, e adultos bactérias presentes no meio de cultura são dissolvidos pelo tratamento. Este tratamento é, então, utilizada para purificar embriões a partir de uma população não sincronizada contendo a maioria dos adultos bem alimentados 8. restrição alimentar é usado para sincronizar as larvas recém-nascidas. Medindo a duração dessas larvas é então usada para detectar defeitos de alongamento. Esta medição é preferido em relação à medição de larvas preso em placas de cultura, porque as larvas que eclodem a partir de embriões não totalmente alongados pode recuperar a &quot;comprimento normal&quot; ao alimentar mas irá manter o seu tamanho reduzido, quando preso na ausência de comida. Aqui, apresentamos protocolos detalhados que permitem a medição da length de alongar embriões, bem como a largura da sua cabeça e cauda utilizando lapso de tempo de microscopia DIC e análise de imagem (Protocolo 1). Nós também fornecemos protocolos detalhados para medir o comprimento de larvas sincronizados usando análise de imagem (Protocolo 2) e citometria de fluxo (Protocolo 3).

<table><tbody><tr><td>Ágar&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (Cloreto de Cálcio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Solução de limpeza&nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>Corrediças de vidro</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>Partículas de controle de alta</td><td>fluorescência união Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato de potássio, dibásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4 (fosfato de potássio, monobásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (sulfato de magnésio)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(fosfato de sódio, dibásico)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (cloreto de sódio)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Goma de Desenho Pebeo 45&nbsp; ml</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>PDG033000</td><td>qualquer loja de arte/artesanato</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr>União<td>tampão de bainha</td><td>Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>união Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

novas métricas para caracterizar embryonic alongamento do nemátodo<em&gt; caenorhabditis elegans</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Dissecar as vias de sinalização que controlam a alteração dos processos morfogênicos durante o desenvolvimento embrionário requer métricas robustas e sensíveis. O alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans é um estágio tardio do desenvolvimento que consiste no alongamento do embrião ao longo de seu eixo longitudinal. Este estágio de desenvolvimento é controlado pela comunicação intercelular entre as células hipodérmicas e os músculos subjacentes da parede corporal. Esses mecanismos de sinalização controlam a morfologia das células hipodérmicas remodelando o citoesqueleto e as junções célula-célula. A medição da letalidade embrionária e da parada do desenvolvimento nos estágios larvais, bem como a alteração do citoesqueleto e das estruturas de adesão célula-célula em células hipodérmicas e musculares, são fenótipos clássicos que têm sido usados há mais de 25 anos para dissecar essas vias de sinalização. Estudos recentes exigiram o desenvolvimento de novas métricas visando especificamente o alongamento precoce ou tardio e caracterizando defeitos morfogênicos ao longo do eixo ântero-posterior do embrião. Aqui, fornecemos protocolos detalhados que permitem a medição precisa do comprimento e da largura dos embriões alongados, bem como do comprimento das larvas sincronizadas. Esses métodos constituem ferramentas úteis para identificar genes que controlam o alongamento, para avaliar se esses genes controlam as fases inicial e tardia desse estágio e são necessários uniformemente ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Cabeça-, Cauda e Rácio de cabeça / cauda de largura são métricas robusto. Os protocolos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso para caracterizar a função dos reguladores e dos efectores de Rho GTPases pix-1, Pak-1 e deixou-502 durante o alongamento precoce 7.<...

Aqui detalhamos protocolos projetados especificamente para monitorar defeitos morfogênicos que ocorrem durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário do nematóide Caenorhabditis elegans. Em última análise, esses protocolos são projetados para identificar genes que regulam essas fases e caracterizar suas necessidades diferenciais ao longo do eixo ântero-posterior do embrião.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

O objetivo geral deste grupo de experimentos é identificar defeitos no desenvolvimento do nematodo Caenorhabditis elegans durante as fases inicial e tardia do alongamento embrionário. Este método pode responder a uma questão fundamental na área da genética do desenvolvimento. Ele permite a caracterização de genes que controlam uma fase tardia do desenvolvimento embrionário de Caenorhabditis elegans, denominada alongamento embrionário.A principal vantagem desse grupo de técnicas é que elas identificam genes que controlam tanto a fase inicial quanto a fase tardia do alongamento, bem como aqueles que regulam processos morfogenéticos na parte anterior ou posterior do embrião. Vou demonstrar o procedimento juntamente com Olivier Rocheleau-Leclair, um ex-aluno do laboratório. Esse procedimento exige lentes DIC, prisma e um sistema de captura de vídeo para microscopia de lapso de tempo de pilhas Z.Primeiro, posicione a amostra montada sobre lâmina para visualização. Os detalhes do preparo estão no protocolo textual. Iniciando em baixa magnificação, identifique os embriões em seus estágios pré-morfo gênicos.Em seguida, adicione uma gota de óleo e utilize uma objetiva mais potente. Agora, identifique os pontos superior e inferior dos embriões para registrar e defina os parâmetros da pilha Z. Configure o intervalo de tempo para capturar imagens a cada dois minutos.Certifique-se de que o obturador da luz esteja fechado entre as aquisições de imagens. O tempo necessário para capturar o evento inicial de alongamento pode variar de uma a oito horas, dependendo do estágio do embrião. Agora, execute o programa de aquisição de imagens e salve os resultados.Em seguida, prossiga com a análise utilizando o software Fiji ImageJ. Após carregar as imagens, escolha o modo de visualização Hyperstick. Nesse modo, ajuste o brilho e o contraste aplicando o Modo Automático nas Tabelas de Consulta.Em seguida, vá até Analisar Definir Medidas e configure os parâmetros. Para cada embrião, defina a barra de escala Z para focar na faringe, que é uma boa referência para o ponto central do embrião. Agora, ajuste a barra de escala de tempo para o início da alongamento inicial de um embrião específico.Anote este tempo. Em seguida, calcule o comprimento do embrião utilizando a ferramenta Analisar Medir para traçar uma linha desde a ponta da cauda até a boca ao longo da linha média. Anote este comprimento.Em seguida, ajuste o ponto temporal ao final do evento de alongamento inicial e repita a medição do comprimento. Utilize esses valores para calcular a duração do alongamento inicial e o aumento de comprimento durante o alongamento inicial. A alteração na largura também pode ser medida usando uma ferramenta de linha reta para traçar uma linha ao longo da linha média da cabeça.Esta é uma boa localização para medições consistentes. Faça o mesmo na linha média da cauda e, em seguida, calcule a razão entre cabeça e cauda para qualquer ponto temporal e use isso para pontuar as alterações na largura. Para este protocolo, um citômetro de fluxo deve ser preparado para o fluxo de partículas grandes.Essa máquina se torna essencialmente um classificador de vermes. Antes de iniciar, ligue o bloco do laser, o compressor, o classificador de vermes e o software. No software, pressione Iniciar e verifique o Controle do Laser Argônio.Selecione o modo de execução e deixe o laser aquecer até atingir cerca de 10 miliwatts de potência, então selecione Concluído. Deixe a pressão estabilizar por pelo menos 15 minutos. Agora, prepare a amostra.Primeiro, carregue 10 microlitros de L1 sincronizado do tipo selvagem em uma cápsula de Petri e estime a fração de ovos mortos sob um microscópio. Se a estimativa for superior a 20%, não utilize a amostra. Transfira cerca de 700 microlitros de L1 sincronizado em solução M9 para um tubo de 15 mililitros e adicione iodeto de propídio até 10 microgramas por mililitro.Deixe a coloração atuar por 30 minutos à temperatura ambiente. Agora, prepare o sistema. É essencial ajustar a vazão usando os Controladores de Fluxo de Reagente e de Amostra para 5,1 e 5,51, respectivamente.Quando as pressões se estabilizarem, clique na caixa Pressão OK. Em seguida, use o comando Adquirir e mova manualmente o túbulo para remover quaisquer bolhas do canal entre o copo da amostra e a câmara de análise. A Janela de Aquisição mostrará eventualmente que não há bolhas presentes.Isso também é essencial para o experimento. Agora, defina os parâmetros para as medições de Fluorescentes e TOF. Ajuste as escalas para TOF, EXT, Verde, Amarelo e Vermelho para 256.Em seguida, ajuste o Ganho conforme indicado. Depois, defina o Controle de PMT em 700 para Verde e Amarelo e em 900 para Vermelho. Agora, calibre o classificador de vermes.Carregue 20 mililitros de partículas de controle de uso geral com alta fluorescência em um copo de amostra e insira-o no classificador. No software, selecione Executar Partículas de Controle no menu Ferramentas e clique em Adquirir. Verifique se o coeficiente de variação resultante é maior ou igual a 11 e se a média é igual a 21 mais ou menos seis.Se esse não for o caso, tente limpar os túbulos clicando no botão Limpar ou agitando o canal de fluxo. Agora, saia do modo Partículas de Controle desmarcando o comando em Ferramentas. Uma vez finalizada a coloração de 30 minutos dos vermes com iodeto de propídio, adicione 10 mililitros de M9 aos vermes corados e misture.Incube por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente. Agora, retire cinco mililitros da diluição e adicione a um copo de amostra com 15 mililitros de M9. Passe essa diluição pelo classificador de vermes. Pressione o botão Adquirir e observe a taxa de fluxo.Pode ser necessário ajustar a concentração de vermes para obter um bom fluxo, em algum lugar entre 15 e 25 objetos por segundo. Uma vez alcançada a concentração apropriada dos objetos, adicione partículas controle ao teste para obter uma concentração final de aproximadamente 0,5 a 1x partículas controle na solução. Agora, ajuste o Parâmetro de Gating no menu Gating para TOF versus Verde.Em seguida, ajuste os parâmetros de classificação para TOF versus Red. Isso permitirá separar as partículas de controle dos animais mortos e dos animais vivos. Agora, execute o experimento clicando em Acquire.Analise cerca de 10.000 objetos, o que corresponde a aproximadamente 8.000 animais. Em seguida, interrompa o experimento e clique em Armazenar para salvar os dados como um arquivo de texto para análise. Para estabelecer a robustez da medição da largura da cabeça, a medição foi realizada independentemente cinco vezes em 12 embriões do tipo selvagem no estágio de 1,2 dobra.Não houve variações entre os dados ao aplicar o teste de Brown-Forsythe. A reprodutibilidade e os efeitos de lote associados à medição da largura da cabeça foram testados utilizando imagem DIC 4D em três dias diferentes. Entre esses três grupos de medição, não foram encontradas variâncias nem efeitos de lote.Os dois protocolos descritos foram utilizados para avaliar o comprimento de larvas paralisadas em linhagens selvagens e mutantes. A análise de imagem forneceu medidas absolutas de comprimento em micrômetros. Os mutantes foram menores que os selvagens neste experimento.A medição de comprimento por citometria de fluxo forneceu resultados comparáveis. No entanto, essas medições foram muito mais robustas. Assim, este método deve elucidar efeitos mais sutis em populações mutantes.Ao realizar este procedimento, é importante manter uma taxa de fluxo constante durante o experimento para garantir uma comparação justa entre as linhagens analisadas. Após dominado, o método de medição do comprimento larval por citometria de fluxo permite a caracterização de 18 a 24 condições ou linhagens mutantes por dia, mesmo considerando a calibração inicial do equipamento. Após seguir este procedimento, somos capazes de estudar a morfologia da célula hipodérmica.Para isso, podemos usar marcadores fluorescentes e microscopia confocal para caracterizar a função molecular dos genes identificados. Não se esqueça de que o iodeto de propídio pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de luvas e óculos de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

Aprenda a caracterizar defeitos morfogênicos durante o alongamento embrionário em Caenorhabditis elegans usando microscopia de contraste de interferência diferencial. Este método identifica genes reguladores em diferentes fases e regiões do embrião.

Novas métricas para Caracterizar Embryonic Alongamento do nemátodo

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