Isolement de CD146 ⁺ Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

L’objectif global de cette procédure est de caractériser in vitro des cellules stromales mésenchymateuses résidentes CD146 positives ou des CSM isolées du poumon de rat en utilisant une combinaison de digestion enzymatique, de séparation par gradient de densité, d’adhérence plastique et de tri des billes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies pulmonaires sur la façon dont les CSM pulmonaires sont infectées dans la maladie et comment elles contribuent à la modulation immunitaire et à la réparation des tissus. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est rapide, reproductible et facilement applicable à différentes espèces d’animaux ou de tissus de laboratoire.

Arul Vadivel, un associé de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration des premières étapes de la procédure. Pour retirer le poumon du thorax, tenez la trachée avec de petites pinces et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour séparer la trachée du côté rostral. Ensuite, tout en tirant doucement le paquet pulmonaire hors du thorax, coupez tout tissu conjonctif du côté dorsal le long de la cage thoracique.

Coupez le long du diaphragme pour sectionner les poumons de l’aorte et de l’œsophage, et utilisez de la gaze pour retirer doucement tout sang restant du tissu pulmonaire. À l’aide de ciseaux, retirez la trachée et les bronches et placez soigneusement les lobes pulmonaires dans un tube de 50 millilitres contenant 35 millilitres d’anticoagulant CPDA froid et de PBS pour éliminer le sang et les débris. Après cinq minutes, transférez les poumons dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 35 millilitres de PBS stérile à température ambiante.

Et retournez doucement pour retirer le citrate. Après cinq minutes, rincez les poumons dans un nouveau tube de 50 millilitres contenant 35 millilitres de PBS stérile à température ambiante Dulbecco complété par du pyruvate de sodium et du glucose et inversez doucement. Transférez ensuite les poumons dans un autre tube de 50 millilitres et utilisez un scalpel pour hacher finement le tissu contre la paroi du tube.

Il est très important de couper le tissu en très petits morceaux pour assurer un rendement cellulaire maximal. Et de travailler rapidement pour assurer une viabilité cellulaire robuste. Lorsque tout le tissu a été haché, ajoutez de l’enzyme fraîchement préparée dans le tube et fermez hermétiquement le couvercle.

Ensuite, incubez les morceaux de tissu à 38 degrés Celsius en agitant doucement pour la période de digestion appropriée. À la fin de l’incubation, arrêtez la digestion avec 200 microlitres d’EDTA filtré stérile. Ajoutez 20 millilitres de PBS complété par du FBS à la boue tissulaire et faites passer toute la suspension à travers une crépine cellulaire de 100 microns dans un nouveau tube de 50 millilitres.

Rincez ensuite le tube de digestion et la passoire cellulaire avec 10 millilitres de FBS/PBS et tirez le lavage avec un échantillon filtré. Après avoir fait tourner les cellules deux fois, remettez en suspension la deuxième pastille dans quatre millimètres de FBS/PBS à température ambiante. Et superposez lentement les cellules sur trois millilitres de milieu à gradient de densité à un angle supérieur à 45 degrés.

En tapotant à un angle supérieur à 45 degrés entre la suspension de la cellule et le milieu de gradient de densité, on empêche les forces pures de mélanger les cellules avec le milieu de gradient, ce qui permet de créer des couches, si le mélange se produit, il n’y aura pas de gradient de densité. Séparez les cellules par centrifugation et collectez l’interphase. Ensuite, lavez les CSM pulmonaires dans 10 millilitres de PBS stérile et remettez la pastille en suspension dans un milieu de culture de CSM pulmonaire complet préchauffé pour le placage.

Pour isoler la population de cellules CD146 positives, enrobez d’abord des billes magnétiques de 10 microgrammes d’anticorps secondaires biotinylés pour 100 microlitres de billes magnétiques, dans un flacon cryogénique stérile à fond rond de deux millilitres dans des conditions stériles. Incuber les billes et l’anticorps sur un mélangeur d’échantillons rotatif pendant 30 minutes à température ambiante et 30 tr/min. Ensuite, mettez en suspension les billes conjuguées d’anticorps dans 1,5 millilitre de PBS supplémenté en BSA et transférez les billes dans un tube de cytométrie à flux rond de trois millilitres.

Rincez le flacon cryogénique avec 1,5 millilitre supplémentaire de BSA/PBS et tirez le nettoyant avec les billes. Placez le tube sur un aimant approprié pendant deux minutes jusqu’à ce que toutes les billes soient fixées à la paroi arrière du tube et que la solution devienne claire. Retirez ensuite le surnageant et lavez les billes deux fois de plus avec trois millilitres de BSA/PBS.

Rincez les CSM trois fois avec du PBS non supplémenté. Après le dernier lavage, traitez les cellules avec une solution douce sans trypsine pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque toutes les cellules se sont détachées, ajoutez du milieu de culture MSC pulmonaire frais et faites tourner les cellules.

Remettez la pastille en suspension dans du PBS plus BSA et comptez les cellules. Ensuite, transférez les cellules dans un tube de trois millilitres contenant l’anticorps primaire CD146, fermez le tube et incubez les cellules sur un mélangeur d’échantillons rotatif à 15 tr/min et quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois dans trois millilitres de PBS plus BSA en remettant en suspension la deuxième pastille dans trois millimètres de billes conjuguées d’anticorps secondaires.

Après 30 minutes sur le mélangeur d’échantillons rotatif à quatre degrés Celsius, placez le tube sur l’aimant et utilisez une pipette pasteur stérile pour retirer lentement et soigneusement les cellules négatives. Ensuite, avec le tube retiré de l’aimant, remettez les cellules en suspension dans trois millilitres de PBS complété par BSA et répétez le processus de sélection quatre fois de plus. Après l’élimination de la dernière cellule négative, laver les CSM pulmonaires positives CD146 dans un milieu de culture préchauffé.

Enfin, remettez en suspension les cellules conjuguées dans un milieu de culture de cellules stromales mésenchymateuses de poumon frais et placez 5 000 cellules par centimètre carré dans un flacon de culture de taille appropriée. L’adhérence plastique suivie de trois à cinq jours de culture enrichit les gradients de densité, la séparation de la population interphase pour le CD90. CD73. et CD-146 CSM pulmonaires positives.

De plus, ces cellules sont capables d’une efficacité unitaire de formation de colonie d’environ 30 %, ce qui est beaucoup plus élevé que celui généralement rapporté pour la moelle osseuse ou d’autres sous-ensembles de CSM qui se différencient le long des trois lignées classiques de CSM. La sélection positive au sein de la sous-population CD146 positive aboutit apparemment à une population cellulaire fortement enrichie en CSM pulmonaires, comme le démontre un pourcentage plus élevé de cellules exprimant des marqueurs de surface associés aux CSM. Ces cellules présentent également un potentiel de formation de colonies considérablement plus élevé et une réponse de différenciation plus forte, en particulier dans les cellules de la lignée chondrogénique par rapport à la population totale de cellules mésenchymateuses obtenue avant la sélection de CD146.

Il convient de noter que ces CSM pulmonaires forment très peu de véritables adipocytes, présentant beaucoup plus de cellules en forme de fuseau remplies de petites vésicules lipidiques, reflétant peut-être la lignée des lipofibroblastes qui est cruciale à la fois pour le développement pulmonaire et le soutien des cellules alvéolaires de type deux. Une fois maîtrisée, cette technique peut produire des CSM pulmonaires positives pour CD146 en six à 10 jours, bien que le rendement dépende de l’âge et de l’espèce de l’animal. Lors de cette procédure, il est important de travailler rapidement pour préserver la viabilité des cellules.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que la réaction lymphocytaire mixte ou les SA de cicatrisation, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur l’efficacité des CSM à inhiber la prolifération des lymphocytes T et à favoriser la cicatrisation des plaies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les CSM pulmonaires CD146 positives à l’aide de la digestion enzymatique, de la séparation par gradient de densité, de l’adhérence plastique et du tri des billes.