تنظيم جينية من القلب تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنسجة

الهدف العام من تطبيق مناهج الترسيب المناعي للكروماتين للتمييز بين الخلايا الجذعية الجنينية أو الأنسجة الجنينية القلبية ، هو الكشف عن التنظيم اللاجيني لتطور القلب. نظرا لأن الضبط الدقيق للنسخ الجيني أثناء تطور الحبل الجنيني يتم تنظيم المكونات اللاجينية الوراثية. يعد ترسيب الكروماتين المناعي نهجا مناسبا لفهم هذه العملية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا استهداف موضع على وجه التحديد وإلقاء نظرة على علامات الوراثة اللاجينية الموجودة على تلك القطعة المحددة من الحمض النووي. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتنظيم اللاجيني لنمو القلب. يمكن أيضا تطبيقه على أعضاء أخرى أو أي نوع من أنواع الخلايا.

هذه إيمين. هي طالبة دكتوراه في المختبر وستجري التجربة اليوم. يستخدم هذا الإجراء الخلايا الجذعية الجنينية أو الخلايا الجذعية الجنينية.

الأجسام الجنينية المتولدة من الخلايا الجذعية الجنينية وأنسجة القلب الجنينية التي تم تشريحها من أجنة الفئران E9.5. إصلاح الخلايا والأنسجة. استخدم 1٪ فورمالديهايد في PBS للخلايا و PB2 المخزن المؤقت لنفاذية الأنسجة الجنينية.

ضع الأنابيب على شاكر مداري بسرعة 60 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق بالضبط. أوقف تفاعل الربط المتقاطع بإضافة الجلايسين إلى التركيز النهائي البالغ 125 ملليمولار واحتضانه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري بسرعة 60 دورة في الدقيقة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من PBS.

والأنسجة الجنينية في مليلتر واحد من PB2. جهاز طرد مركزي عند 1000 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأضف المخزن المؤقت المعني لغسل ثان.

أضف مثبطات الإنزيم البروتيني إلى المخازن المؤقتة PB1 و PB2 على الجليد. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت PB1 المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني إلى حبيبات الخلية والماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا. بنفس الطريقة ، أعد تعليق الأنسجة الجنينية في مليلتر واحد من PB2 المكمل بمثبطات البروتين.

بعد ذلك ، استخدم حقنة سعة ملليلتر واحد بإبرة قياس 21 لتجانس الخلايا أو الأنسجة. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل. احتضان الخلايا والأنسجة المتجانسة عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

تدور عند 3000 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كل بيليه في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للصوتنة المعني ، مع استكماله بمثبطات البروتياز. انقل معلق الخلية إلى أنبوب معتمد خال من RNase و DNase و pyrogen لمنع أي تدهور للحمض النووي واحتضانه لمدة 15 إلى 30 دقيقة على الجليد.

لتوضيح الكروماتين ، صوتنة العينات عند أربع درجات مئوية باستخدام برنامج الصوتنة المناسب لكل مادة. اضبط مدة الصوتنة اعتمادا على ما إذا كان سيتم استخدام الحمض النووي لتفاعل البوليميراز المتسلسل أو التسلسل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلية المحللة صوتنة لمدة 10 دقائق.

انقل المادة الطافية وهي الكروماتين الموجود في المحلول من كل عينة إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مليلتر وتخلص من الحبيبات. خذ 1.5 ميكرولتر من كل عينة وقم بتخفيفها 1:10 بالماء. تقييم الكثافة البصرية لجميع العينات في مقياس الطيف الضوئي النانوي لتحديد تركيز البروتين.

قبل ترسيب الكروماتين المناعي ، قم بإعداد حبات البروتين A المترافقة عن طريق غسلها كما هو موضح في نص البروتوكول. في أنبوب نظيف سعة 1.5 مليلتر ، يجمع بين الجسم المضاد المرتفع ضد الهستونات المعدلة أو عوامل النسخ ، و 20 ميكرولترا من الخرز المترافق للبروتين المغسول A ومليلتر واحد من المخزن المؤقت C المكمل بمثبطات البروتياز. احتضان العينات على دوار بسرعة 40 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين على الأقل عند أربع درجات مئوية.

اغسل مجمعات حبات الأجسام المضادة ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت C كما هو موضح في نص البروتوكول. قم بإعداد أنبوبين ، أحدهما يحتوي على 150 ميكروغراما من مجمعات حبات الكروماتين والأجسام المضادة والآخر يحتوي على 150 ميكروغراما من الكروماتين و 20 ميكرولتر من الخرز المغسول. أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت C المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني لكل أنبوب واحتضان العينات على عجلة دوارة بسرعة 40 دورة في الدقيقة طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

عند اكتمال الترسيب المناعي طوال الليل ، ضع العينات في الرف المغناطيسي واسترجع المادة الطافية التي تحتوي على كروماتين الجسم المضاد غير المرتبط. قم بتخفيض البروتين المرتبط بالجسم المضاد عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت D1 إلى المواد المغسولة. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة عند 50 درجة مئوية في كتلة تسخين.

بعد 20 دقيقة ، قم بإزالة العينات من كتلة التسخين وضعها في الرف المغناطيسي. استرجع المادة الطافية في أنبوب نظيف سعة 1.5 مليلتر وتخلص من الخرز. لعكس الارتباط المتقاطع ، أضف خمسة مولي كلوريد الصوديوم إلى المادة الطافية للحصول على تركيز نهائي يبلغ 200 ملليمول.

قم بإعداد عينة إدخال من الكروماتين في أنبوب نظيف سعة 1.5 مل. استخدم نفس كمية الكروماتين الموجودة في عينة الترسيب المناعي في حجم نهائي قدره 150 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase و DNase وخمسة مولات كلوريد الصوديوم إلى تركيز نهائي يبلغ 200 ملليمول. احتضان العينات طوال الليل عند 65 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة العينات من كتلة التسخين. أضف EDTA إلى التركيز النهائي البالغ 12.5 ملليمولار والبروتيناز K إلى التركيز النهائي البالغ 250 ميكروغرام لكل مليلتر وهضمه عند 55 درجة مئوية لمدة ساعتين. ابدأ هذا الإجراء بإعداد الخرز.

قم أولا بإحضار الخرز إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. ثم دوامة الخرز بدقة وبسرعة ماصة واحدة من الخرز إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 ملليلتر. اضبط أنبوب الخرز على المغناطيس لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتمكن المحلول من توضيح المادة الطافية والتخلص منها.

قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس. أضف ملليلتر واحد من 0.5 مولار EDTA واخلطه عن طريق دوامة قصيرة. اغسل الخرزات مرتين بهذه الطريقة وتخلص من المادة الطافية بعد الغسيل النهائي.

قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس. أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت E وأعد تعليق الخرز ببطء. انقلي الخليط بالكامل إلى 50 مل من العازلة E.ضعيها على شاكر واتركيها تمتزج ببطء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، اختبر حبات ربط الحمض النووي باستخدام سلم DNA واحد كيلوبايت وثلاث نسب مختلفة من حجم الخرز إلى حجم الحمض النووي. تم تحديد نسبة 2.5 / 1 لتعمل بشكل أفضل لربط الحمض النووي. لاستخدام الخرزات لتنقية الحمض النووي ، أضف 425 ميكرولتر أو 2.5 محجم من الخرزات إلى كل عينة من الحمض النووي وأعد تعليقها ببطء عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ضعه على المغناطيس لمدة خمس دقائق. ثم استنشق وتخلص من المادة الطافية.

اغسل مرتين باستخدام الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ عن طريق إضافة 600 ميكرولتر إلى كل أنبوب. الانتظار لمدة دقيقة واحدة ، ثم الشفط والتخلص من المادة الطافية. امنح الأنابيب دورانا سريعا.

ضع الأنابيب على المغناطيس. قم بإزالة آخر قطرات الإيثانول واتركها تجف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة العينة من المغناطيس وتخلص من الحمض النووي بإضافة 20 ميكرولترا من الماء الخالي من DNase و RNase. دوار.

كشف الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز عن أحجام شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها بعد الارتباط المتقاطع العكسي للحمض النووي الكامل الصوتي المستخرج من خلايا الفئران الجذعية الجنينية والأجسام الجنينية وأنسجة القلب الجنينية. تم تصميم تجربة الترسيب المناعي للكروماتين للنظر في التنظيم اللاجيني للجينات الانتقالية الظهارية الوسيطة في النوع البري أو الخلايا المتحولة وراثيا ، عندما تتمايز الخلايا الجذعية الجذعية نحو مصير خلية الأديم المتوسط. تمت مراقبة ربط الهستونات المعدلة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لمحفزات أو معززات جينات E-Cadherin و Twist.

تم إجراء الترسيب المناعي المتسلسل للكروماتين على الكروماتين المستخرج من أربعة خطوط خلايا ES بشرية باستخدام الأجسام المضادة لعلامة تنشيط الكروماتين متبوعة بالأجسام المضادة لعلامة مكبوتة. يتم تعديل هذه العلامات عندما يتم تحدي الخلايا بواسطة المورفوجينات ولكنها متغيرة اعتمادا على خطوط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. على الأرجح بسبب الأكياس الأريمية الأصلية التي اشتقت منها.

يمكن أيضا تطبيق ترسيب الكروماتين المناعي على الكروماتين المستخرج من مناطق قلبية جنينية محددة. يوضح هذا الشكل المناطق الجينومية لجينات القلب و Nkx2.5 و TBx5 المخصبة في الهيستون المعدل ومنطقة جينومية واحدة من الجين المحدد لجهاز تنظيم ضربات القلب Shox2 غير مخصبة وغير معبرا في البطين. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تأخذ كفاءة صوتنة قبل بدء بروتوكول IP. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل Eth-ek-se-ek من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل استجواب الحالة القديمة للكروماتين سواء كانت مفتوحة أو مغلقة أو مراقبة تباعد النيوكليوسومات. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم التخلق لاستكشاف أي تنظيم لاجيني لقرارات مصير الخلية في أي نوع من الخلايا أو العضو الجنيني.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحوصات ترسيب الفروماتين المناعي.