Выделение и дифференциация полученных из жировой ткани стволовые клетки из свиных подкожного жирового ТКАНЕЙ

Общей целью этой процедуры является выделение стволовых клеток, полученных из жировой ткани, из подкожных белых жировых тканей свиней для оценки их способности дифференцироваться в мезенхимальные адипоциты, остеоциты и хондроциты. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы исследований ожирения. Это хороший инструмент для раскрытия молекулярного механизма, участвующего в регуляции развития жировой ткани.

Основным преимуществом этого метода является то, что можно собрать большое количество стромоваскулярных клеток, что позволяет провести глубокий анализ дифференцировки и биологии адипоцитов. Применение этого метода имеет отношение к исследованиям в области терапии стволовыми клетками, поскольку стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, демонстрируют мультипотенцию для трансдифференцировки в множественные клеточные линии. Начните с того, что положите поросенка в положении лежа на чистый хирургический стол.

Сбрейте всю шерсть по средней линии от шеи до хвоста и трижды потрите кожу спины 7,5% повидон-йодом. После третьего скраба дайте йоду посидеть на поверхности кожи около 10 минут. Затем распылите на кожу 70% этанола.

И используйте марлевые салфетки, пропитанные этанолом, чтобы протереть кожу в одном направлении, чтобы удалить дезинфицирующее средство до тех пор, пока не исчезнет явный цвет. Далее сделайте разрез от области шеи вниз к ноге. Затем, удерживая жир и кожу щипцами, с помощью скальпеля отделяют спинной слой свиного жира подкожной жировой клетчатки и прилегающий слой кожи от мышц.

Немедленно погрузите кожу и жировую ткань в стерилизованный стакан объемом 200 миллилитров, содержащий бессывороточный DMEM при температуре 37 градусов Цельсия, и распылите на внешнюю сторону стакана 70% этанола. Затем поместите стакан в колпак для клеточных культур с ламинарным потоком и поместите рядом со стаканом стерилизованную трехслойную крышку из фольги размером 40 на 30 сантиметров. Перенесите ткань кожей вниз на фольгу.

И используйте щипцы и ножницы, чтобы обрезать оставшуюся мышечную ткань от жировой ткани. Разрежьте жир на квадратные кусочки размером 7 на 7 сантиметров, а затем переложите кусочки жира в новую стерилизованную 200-миллилитровую мензурку, содержащую бессывороточную жидкость при температуре 37 градусов по Цельсию. Теперь поместите специальный держатель для ломтиков, оснащенный лезвием для слайсера из углеродистой стали, на защитную фольгу и поместите один из кусочков жира на слайсер слоем жира вниз.

Нарежьте жир на кусочки толщиной примерно 1 миллиметр как можно ближе к, но не разрезая кожу. Затем с помощью ножниц измельчите кусочки жировой ткани как можно мельче и добавьте кусочки в 250-миллилитровую колбу Эрленмейера, содержащую отфильтрованную среду для пищеварения с добавлением коллагеназы. Втяните колбу с помощью вращения в течение 90 минут при 45 оборотах в минуту, в орбитальном вибростенде при температуре 37 градусов Цельсия.

Когда среда для разложения превращается в суспензию, без значительных тканевых комков, прекратите разложение с помощью питательной среды, содержащей DMEM F-12 с 10% FBS. Чтобы собрать стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, отфильтруйте переваренную суспензию жировой ткани через один слой шифона в стерилизованную серологическую бутылку объемом 250 миллилитров, используя щипцы для вдавливания середины шифона, чтобы направлять и способствовать прохождению пищеварения. Слейте воду и скрутите шифон с помощью щипцов, чтобы завершить проход, и распределите среду по четырем 50-миллилитровым коническим центрифужным пробиркам.

Соберите стромально-сосудистые клетки с помощью центрифугирования. Затем удалите надосадочную жидкость, не повреждая гранулы, чтобы удалить большую часть верхнего жирового слоя, содержащего зрелые адипоциты. Далее повторно суспендируйте гранулы в 10 миллилитрах DMEM с помощью пипетирования и осторожного встряхивания.

Снова раскрутите клетки и снова суспендируйте гранулы в 10 миллилитрах буфера для лизиса ACK. Через семь минут при комнатной температуре прекратите лизирование эритроцитов с добавлением по 10 миллилитров DMEM в каждую пробирку, аккуратно встряхивая пробирки для перемешивания. А затем снова прокрутите ячейки вниз.

Промойте клетки еще два раза 10 миллилитрами DMEM, а затем объедините надосадочную жидкость через 100-микронный фильтр в одну 50-миллилитровую коническую пробирку. Осторожно пипетируйте клеточную суспензию несколько раз, чтобы равномерно распределить клетки и подсчитать клетки по исключению Трипанового синего. Наконец, засейте стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, в соотношении от 6 до 10 до 4-го квадратного сантиметра в культуральный контейнер соответствующего размера в среде для культивирования клеток.

И инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2, чтобы облегчить образование монослоя. Морфология стволовых клеток свиньи, полученных из жировой ткани свиньи, аналогична стволовым клеткам, полученным из жировой ткани мыши или человека, с морфологией, похожей на расширенное стекловолокно, наблюдаемой через 24 часа после посева. Стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, сливаются в течение 72 часов, после чего они готовы к дифференцировке адипоцитов или другого мезенхимального типа.

Эти клетки также демонстрируют сильный адипогенный потенциал после химической индукции, а зрелые адипоциты могут наблюдаться после девяти дней дифференцировки, причем более 90% стволовых клеток, полученных из жировой ткани свиньи, демонстрируют адипогенную дифференцировку. Поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток, включая CD 29, CD 44, CD 90 и MHC 1, высоко экспрессируются на стволовых клетках, полученных из жировой ткани свиньи, в то время как CD 4a, CD 31, CD 45 и MHC II едва обнаруживаются, что свидетельствует о том, что эти стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, демонстрируют характеристики мезенхимального типа без значительного загрязнения эндотелиальными или гемопоэтическими стволовыми клетками. Кроме того, дифференцированные стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, могут быть идентифицированы как адипоциты, остеоциты или хондроциты с помощью специфических красителей, окрашивающих ткани, демонстрируя, что эти клетки, полученные из стромально-васкулярной фракции, сохраняют мультипотентность, типичную для предшественников мезенхимального типа.

При выполнении этой процедуры важно помнить о хорошей асептической технике культивирования клеток и выполнять все шаги как можно быстрее. Для максимального повышения жизнеспособности клеток. После освоения клеток можно собрать от двух до трех свиней за шесть часов, если техника выполнена правильно.

Этот стандартный метод проложил путь исследователям ожирения в области диабета к изучению молекулярных переключателей, таких как факторы транскрипции, которые контролируют дифференцировку адипоцитов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выделить стволовые клетки, полученные из жировой ткани свиньи, и оценить мультиспособность этих клеток дифференцироваться в адипоциты, остеоциты и хондроциты.