Name: Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Impara la registrazione extracellulare di neuroni unita alla microiontoforesi di sostanze neuroattive in topi svegli. Questa tecnica consente di manipolare gli input sinaptici locali e studiare i sistemi modulatori neuronali senza anestesia.

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Questo progetto è stato finanziato dalla MINECO concede BFU201343608-P e PSI2013-49348-EXP, e la concessione SA343U14 JCYL al finanziamento di base MSM e MRC di ARP. YAA tenuto una CONACYT (216106) e una borsa di studio settembre

Tutte le procedure sperimentali sono state effettuate presso l&#39;Università di Salamanca, con l&#39;approvazione di, e con metodi conformi alle norme del, l&#39;Università del comitato Animal Care Salamanca, nonché le norme dell&#39;Unione europea (direttiva 2010/63 / UE) per l&#39;uso degli animali nella ricerca neuroscientifica. 1. elettrodi di tungsteno Nota: La fabbricazione di elettrodi di tungsteno è basato sulla tecnica originale descritta in Merrill e Ainsworth 27 e Ainsworth et al 28 e eseguita utilizzando la configurazione workstation descritto in Bullock et al 17... <ol><li> Per registrare una sola unità di attività extracellulare dei neuroni IC, usare elettrodi con impedenza punta di 1,5-2,5 MW. Qui, le fasi coinvolte nella produzione di elettrodi di tungsteno sono descritti solo brevemente, poiché una descrizione dettagliata è riportata nei riferimenti sopra citati. </li><li> Mettere fili di tungsteno in un allineamento su misurautensile (Figura 1A) assistere tagliandoli alla lunghezza desiderata. Lo strumento di allineamento consiste di 30 aghi (25 G) incollati in parallelo ad intervalli di 2 mm, con una sosta ad una estremità per limitare la lunghezza dei fili a ~ 40 mm. Fissare accuratamente le estremità dei fili con nastro adesivo, e tagliare il resto del filo con le forbici forti. </li><li> Tirare leggermente dal nastro al fine di rimuovere i fili di tungsteno dallo strumento di allineamento, facendo in modo che tutti i fili rimangono attaccati al nastro. Rotoli il nastro su un fuso ottone lucido (Figura 1B, C), che tiene i fili saldamente contro il mandrino per cui vi è un buon collegamento elettrico. </li><li> Collegare il mandrino ad un motore 5 giri nella stazione di lavoro, e immergere le punte fili sporgenti in una soluzione di incisione (KNO 2, 90 g per 80 ml). Angolo mandrino dell&#39;asse 45 ° rispetto alla superficie della soluzione di attacco. Immergere le estremità dei fili in modo che ~ 1/3 dei fili di contatto della soluzione. </li><li> ImmERSE un elettrodo dell&#39;asta del carbonio nel bagno di attacco per chiudere il circuito. Utilizzare un pennello treccia di rame molla di applicare la fornitura di attacco al mandrino mentre il mandrino è in rotazione. Regolare la corrente che viene fatta passare attraverso gli elettrodi e la soluzione di attacco a 250 mA. Interrompere l&#39;incisione punta quando la corrente scende a 200 mA. Le punte di filo verranno incisi in punti molto sottili. </li><li> Far passare un filo affilato attraverso una fiamma per rimuovere eventuali residui di grasso ed adesivo. Posizionare il filo (estremità smussata prima) in un capillare di vetro borosilicato (1,5 mm di diametro, 0,86 millimetri ID) con la sua estremità inferiore bloccato con plastilina. Fissare la pipetta verticalmente in alto e in basso. Estrarre la pipetta utilizzando una bobina di riscaldamento (5 mm di diametro, profondità 5 mm) e uno stantuffo sospesa. Poiché il filo viene tirato dal peso del pistone, il vetro fuso forma una finissima cappotto intorno. </li><li> Rimuovere il vetro che copre la punta alla estremità appuntita dell&#39;elettrodo con l&#39;aiuto di un cordone fuso di sodiotetraborato. Per formare il tallone, mescolare il tetraborato di sodio (~ 0,25 g) con una piccola quantità di acqua (~ 0,5 ml) e lentamente posizionarlo su un elemento riscaldante, finché non si scioglie in un cordone ~ 2 mm di diametro. La temperatura dell&#39;elemento di riscaldamento è controllato da un potenziometro. Posizionare il tallone e resistenza su un braccio manipolatore fisso al tavolo, e spostarla fino al tallone è focalizzata al microscopio a basso ingrandimento. </li><li> Fissare il filo con copertura in vetro a una diapositiva e posizionarlo sotto il microscopio. Spostare la slitta con le manopole di scena fino a quando la punta e tallone tetraborato sono a fuoco. Riscaldare il tallone fino a quando si scioglie un po &#39;, e inserire la punta del filo ~ 10 - 15 micron. Girare il potenziometro riscaldamento spento. Come il tallone si raffredda, si contrae e rimuoverà il vetro dalla punta dell&#39;elettrodo, esponendo il tungsteno sottostante. L&#39;elettrodo di tungsteno è pronto all&#39;uso. </li></ol> 2. multibarrel pipetta di vetro Manufacturing <ol><li> Proteggere le estremità del Multicapillari di vetro barile (cinque barili in H-configurazione) con una guaina termoretraibile, per consentire una migliore presa ai morsetti estrattore e prevenire la rottura, e mettono uno in estrattore verticale. </li><li> Per ottenere lunghezze punta di ~ 15 mm, impostare l&#39;estrattore ai seguenti parametri: Heat: 84, Sub forza magnete: 49, principale forza di magnete: 38. Mettere a punto questi parametri a seconda della particolare configurazione, così come dopo la modifica della termosifone. </li><li> Tirare il capillare per ottenere due pipette con le punte occluse. Montare una pipetta su un vetrino utilizzando plastilina e rompere la punta della pipetta al microscopio fino a quando il diametro esterno è ~ 20 - 30 micron, con le forbici o pinze sottili, o la parte piatta di un bisturi. Se il bordo spezzato è troppo ruvida, raffinarlo utilizzando la tecnica tetraborato tallone descritto nel punto 1.7. </li><li> Posizionare un elettrodo di tungsteno (dalla sezione 1) in un supporto realizzato con un ago 20 G al termine di un 3 assi micropositioner miniatura montato sul maschio microscopioe. Utilizzando pinze, piegare l&#39;estremità dell&#39;elettrodo 5 - 10 °, circa 30 mm dalla punta. </li><li> Sotto il microscopio, allineare con cura l&#39;elettrodo di tungsteno sulla punta multibarrel. Una volta allineata, abbassare l&#39;elettrodo finché non tocca la multibarrel, inserendosi nel solco tra le due canne superiore. Far scorrere la punta dell&#39;elettrodo e farlo fuoriuscire ~ 15 - 20 micron dalla punta del multibarrel. Effettuare l&#39;angolo tra l&#39;elettrodo ed il multibarrel più piccolo possibile per ottenere un incollaggio migliore e un insieme più sottile. </li><li> Applicare una piccola goccia di luce-curabili adesivo di ~ 5 mm di distanza dalle punte. Fate attenzione che la colla non raggiunge la punta per evitare di bloccare i canali multibarrel. </li><li> Curare la colla utilizzando una lampada luce blu a LED. Ripetere la colla applicazione / polimerizzazione, se necessario, per una migliore adesione. </li><li> Spostare palco microscopio delicatamente fino alla fine del tungsteno è liberato dal suo supporto. Rimuovere l&#39;ensemble piggy-back dalla diapositiva. </li><li> avvolgere °e sezione centrale dell&#39;elettrodo piggy-back in un breve tratto di tubo termoretraibile e applicare rapidamente adeguato indurimento resina epossidica per il vetro per garantire ulteriormente l&#39;elettrodo di tungsteno al multibarrel. </li></ol> 3. Farmaci per Microiontophoresis Nota: I farmaci utilizzati per microiontophoresis devono avere una carica elettrica quando disciolto in acqua. Controllare letteratura per vedere se il farmaco di interesse è appropriato per questa procedura. Qui, la procedura per gabazine, un antagonista del recettore GABA A, è descritto. <ol><li> Filtrare l&#39;acqua distillata con un filtro siringa da 0,2 micron per sterilizzare l&#39;acqua e garantire che non contiene soluti. Preparare ~ 1.000 ml di 20 mm gabazine usando questa acqua distillata. </li><li> Regolare il pH della diluizione a 4 con 0,2 micron filtrata NaOH utilizzando un elettrodo di pH fine-tip. </li><li> Conservare 100 - 200 aliquote microlitri a -20 ° C. Scongelare il giorno della registrazione. Quel giorno, prima che l&#39;animale è frenareed, riempire le botti (3 - 5 microlitri) dell&#39;elettrodo multibarrel con i farmaci, utilizzando una microsiringa da 100 microlitri con ago plastica flessibile. </li></ol> 4. Chirurgia e Headpost impianto <ol><li> Effettuare esperimenti in due topi maschi CBA / J (Mus musculus) con pesi di 27 e 30 g. Seguire le procedure chirurgiche e la registrazione di Bryant e colleghi 29, Portfors e collaboratori 30-32, e Duque e Malmierca 26. </li><li> Nei giorni precedenti l&#39;intervento chirurgico, di gestire gli animali e li abituarsi alla camera di registrazione, consentendo loro di esplorare liberamente. Eseguire 3 sessioni al giorno, ciascuna della durata di almeno 30 minuti. In questo modo gli animali sarà più tranquillo e confortevole durante le registrazioni. </li><li> Anestetizzare il mouse usando una miscela di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato per via intramuscolare. Con questa dose l&#39;animale è profondamente anestetizzati per circa 1 ora. Dare dosi supplementari di una third della dose iniziale, se necessario. </li><li> Posto l&#39;animale in una termocoperta regolato per mantenere una temperatura di 38 ± 1 ° C e stabilizzare la testa dell&#39;animale in un telaio stereotassico utilizzando due barre orecchio e un bar morso. Fare attenzione a non forare la membrana timpanica con le barre orecchio. </li><li> Proteggere gli occhi applicando una goccia di gel oftalmico. </li><li> Shave il cuoio capelluto con le forbici e applicare iodopovidone per disinfettare la pelle. </li><li> Usando un bisturi, fare un&#39;incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritirare il periostio che copre il parietale e la parte più rostrale delle ossa occipitali. </li><li> Colla un headpost leggero in duralluminio (peso ~ 0,65 g, lunghezza 30 mm, Figura 2A) con un giro e base piatta (diametro 5 mm) sul cranio. Colla un filo d&#39;argento per mezzo della headpost lasciando sue estremità libera. Il filo di argento viene utilizzato come elettrodo di riferimento per la registrazione elettrofisiologica. </li><li> Applicare uno strato sottile di ligAdesivo HT-induribile sul cranio e la base del headpost. Attendere 10 secondi e posizionare il headpost sopra la zona rostrale delle ossa parietali, lungo la linea mediana. </li><li> Per una resistenza di legame efficace, fotopolimerizzare l&#39;adesivo utilizzando una sorgente di luce blu per 20 sec. </li><li> Praticare tre fori intorno e dietro la base del headpost utilizzando un trapano elettrico e una piccola punta. </li><li> Inserire due viti di orologi (~ 2 mm di lunghezza) nei fori per servire come punti di contatto aggiuntivi tra il cranio e la headstage. Le viti richiedono 1½ giri per ottenere una perfetta aderenza. Testare le viti con pinze per assicurarsi che essi non siano allentati. </li><li> Inserire la punta del filo di terra d&#39;argento nel terzo foro facendo attenzione che i contatti della dura. Applicare una piccola goccia di cianoacrilato resistente colla di acqua per legare il filo al cranio. </li><li> Applicare composito fotopolimerizzabile rinsaldare il vincolo della headpost con il cranio. Coprire la base del headpost, la parte bassa del filo d&#39;argento,e le viti, facendo attenzione a non estendere dietro lambda, per consentire l&#39;accesso durante la registrazione. Cure utilizzando una sorgente di luce blu. </li><li> Ritrarre muscolo alla nuca vicino al suo inserimento sul cranio. Con un piccolo trapano (2,35 mm di diametro), praticare una finestra rotonda appena sotto lambda di sutura e lateralmente alla linea mediana, per esporre il collicolo inferiore (IC). Quando i confini sono sciolti, tirare su l&#39;osso copertura con le pinzette sottili. In caso di emorragia, sciacquare con soluzione salina sterile a freddo per fermarlo. </li><li> Fai un piccolo (~ 1 mm di larghezza e ~ 1 mm di altezza) muro attorno alla finestra con composito e fotopolimerizzare esso. </li><li> Coprire il cranio esposto e muscolo con pomata antibiotica. Poi, bagnare la superficie esposta del IC con soluzione salina sterile e coprire con vaselina, riempiendo il pozzo generato dopo aver effettuato la parete attorno alla finestra di registrazione. </li><li> Iniettare buprenorfina per via sottocutanea (0,03 mg / kg, diluito 1:10 in soluzione fisiologica sterile) come analgesico. </li><li> Mantenere l&#39;animale su tegli riscaldamento coperta fino a quando non si sveglia e tornare alla sua gabbia abitazioni per recuperare da un intervento chirurgico per tre giorni prima di sessioni di registrazione. animali domestici in gabbia abitazioni rat&#39;s individuale per prevenire compagni di gabbia ripulire la gelatina e la headpost toccare il coperchio metallico a griglia. Mettere un po &#39;di arricchimento nella gabbia quando l&#39;animale è unico ospitato. Inoltre, cambiare ogni giorno la segatura per prevenire l&#39;infezione e controllare attentamente che l&#39;animale recupera correttamente e non mostra alcun segno di disagio. Controllare anche se vaselina è sopra la finestra di registrazione proteggere il cervello esposto. </li></ol> 5. registrazione elettrofisiologica e Microiontophoresis <ol><li> Dopo il recupero, dare il tempo di animale per acclimatarsi all&#39;ambiente registrazione e avente la sua testa trattenuto. Acclimatare l&#39;animale fissando la headpost al titolare mentre il mouse è seduto su un dispositivo di immobilizzazione di schiuma imbottita misura scolpito alla sua dimensione del corpo (Figura 2B). Questo lim volontàche i movimenti del mouse e contribuirà alla sua calma. </li><li> Inizia con 10 sessioni minimo e progressivamente aumentare la durata fino a 120 min. Durante la sessione, premiare gli animali con liquidi dolci (latte condensato, diluito in acqua 30:70) ad intervalli di 33. Successivamente, durante la sessione di registrazione, alla stessa ricompensa all&#39;inizio e alla fine della sessione o mentre nessun neurone è isolato. </li><li> Se animale è molto eccitato prima della registrazione, iniettare il acepromazine lieve sedativo (2 mg / kg, intraperitoneale). Secondo il sistema neurale di interesse, il sedativo può influenzare i risultati. </li><li> Lasciate che l&#39;animale liberamente esplorare la camera di registrazione per 5 - 10 minuti. </li><li> Posizionare il corpo dell&#39;animale nel dispositivo di immobilizzazione imbottito in schiuma su misura (Figura 2B). </li><li> Fissare il headpost ad un supporto fissato al telaio stereotassica (Figura 2C). Questo è un buon momento per dare all&#39;animale una ricompensa liquido. </li><li> cover corpo dell&#39;animale con una coperta di cotone e liberamente fissarlo utilizzando un hemicylinder plastica e nastro adesivo. </li><li> Rimuovere la vaselina dalla finestra di registrazione e risciacquare con acqua calda salina sterile. </li><li> attività neurale Record e l&#39;applicazione di iontoforetico gabazine. <ol><li> Posizionare l&#39;elettrodo multibarrel al suo titolare, controllata da un microdrive e attaccato ad un micromanipolatore. </li><li> Collegare i fili per la registrazione, utilizzando piccoli morsetti a coccodrillo. Collegare il terminale positivo al terminale dell&#39;elettrodo di tungsteno, e il terminale di terra al filo d&#39;argento che contatti la dura. </li><li> Inserire un filo d&#39;argento non rivestito all&#39;interno di ogni cilindro, quindi una contatti termine la soluzione e l&#39;altra estremità è accessibile. Collegare tali estremità al dispositivo microiontophoresis, seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Spostare l&#39;elettrodo multibarrel finché la punta la superficie del cervello. Applicare calda salina sterile per prevenire l&#39;essiccazione di the tessuto cerebrale. A quel punto applicare una corrente di ritenzione (-10 nA per gabazine, controllare la letteratura per la particolare farmaco) per evitare perdite del farmaco dalla punta barile, mentre alla ricerca di attività singola unità. </li><li> Utilizzare le tecniche standard per isolare singolo neurone attività extracellulare. Ottenere l&#39;area risposta in frequenza (FRA) del neurone, cioè la combinazione di frequenze ed intensità capaci di evocare una risposta perché il neurone è sensibile a questi suoni 34-36. </li><li> Scegli due frequenze (F1 e F2) che evocano un tasso di fuoco simile e modello. Presentare ciascuna di queste frequenze di stimolo come rara e ripetitivo sotto il paradigma oddball. Nota: Brevemente, nel paradigma oddball, una frequenza (f1) si presenta come stimolo ripetitivo con un&#39;alta probabilità di accadimento, mentre il secondo (f2) è lo stimolo deviante raramente si verificano, intervallati in modo casuale tra quelli ripetitivi. In una seconda sequenza eccentrico, la relativaprobabilità dei due stimoli sono invertiti. Dettagli del paradigma di stimolazione sono stati descritti in precedenza 22,37. </li><li> Rilasciare il gabazine spostando la corrente a valori positivi (10 - 20 nA). Ottenere di nuovo la FRA e ripetere il paradigma oddball sotto l&#39;applicazione gabazine. Mantenere l&#39;espulsione fino a quando un effetto visibile nella frequenza di scarica si osserva; esso solitamente 5 - 20 min, a seconda del particolare farmaco, la sua concentrazione, e la grandezza della corrente di espulsione. Ripetere il protocollo di registrazione per ottenere i valori sotto l&#39;effetto del farmaco. </li><li> Interrompere l&#39;iniezione con il ritorno della corrente ai valori di ritenzione. Attendere l&#39;effetto del farmaco per lavare via controllando che la FRA o la risposta al paradigma oddball torna ai valori di controllo. Nota: Le sessioni di registrazione può durare 2-3 ore al giorno, e si dovrebbe porre termine prima, se l&#39;animale mostra alcun segno di disagio o difficoltà. Dare liquido ricompensa e coprire il cap di registrazioneambrato con vaselina. </li></ol></li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Misurare la FRA prima e durante l&#39;iniezione gabazine così come il livello di SSA. </li><li> Quantificare la forza della risposta SSA dall&#39;indice comune SSA (CSI) e l&#39;indice SSA specifica frequenza (SI) come descritto in precedenza 19,22,23,38,39. Il CSI e SI riflettono la differenza normalizzata tra la risposta neuronale alla rara stimolo e la risposta al ripetitivo. Valori positivi CSI e SI indicano la risposta neurale (picchi per stimolo) è risultata maggiore di rara rispetto ai toni ripetitivi. </li><li> Confrontare i dati dalla condizione di controllo ed espulsione della droga. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il microiontophoresis di sostanze neuroattivi in animali svegli è una tecnica potente per sondare e sezionare il ruolo degli ingressi sinaptici specifici per l&#39;attività di singoli neuroni 40,41. Ancora più importante, questa procedura permette di determinare l&#39;impatto dei neurotrasmettitori e neuromodulatori su circuiti neurali senza l&#39;interferenza potenziale di anestetici. Qui, dimostriamo che l&#39;applicazione gabazine nel IC di topi svegli robusta cambiato la frequenza di sintonizzazione <stro...

L&#39;interazione tra l&#39;eccitazione e l&#39;inibizione neuronale è fondamentale per l&#39;elaborazione delle informazioni sensoriali 1. È anche noto che l&#39;anestesia ha un forte impatto sulla dinamica di attivazione corticale e il pattern temporale degli ingressi sinaptici 2,3. Ad esempio, è stato osservato che gli anestetici alterano la durata di risposte visivamente evocati nei neuroni corticali 3,4. Inoltre, il rapporto tra eccitatori e gli ingressi sinaptici inibitori è diverso in animali anestetizzati e svegli 4,5, alterando sia evocata e tassi di attività spontanee 6,7. Misurando le conduttanze sinaptiche, Haider e colleghi hanno scoperto che l&#39;inibizione 4 abbinato eccitazione in ampiezza in anestesia mentre durante la veglia, l&#39;inibizione era più forte di eccitazione. Questi risultati inducono lo sviluppo di procedure sperimentali per studiare l&#39;impatto degli ingressi sinaptici specifiche sulla elaborazione sensoriale in animali svegli. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; L&#39;espulsione controllato di sostanze neuroattivi cariche applicando piccole iniezioni di corrente (dell&#39;ordine di nA) è stato ampiamente utilizzato per studiare il contributo degli ingressi sinaptici e il ruolo dei recettori delle cellule putativi in elaborazione sensoriale 8-13 . Questa tecnica, nota come microiontophoresis, consente l&#39;applicazione di farmaci in prossimità del neurone registrato, che contribuisce ad un rapido effetto e confinato. Questa procedura è più adatto per studiare effetti locali di sostanze neuroattivi, rispetto all&#39;effetto diffusa suscitata da altre manipolazioni sperimentali come iniezioni sistemiche, microdialisi o l&#39;uso di tecniche optogenetic. Di solito, una configurazione degli elettrodi piggy-back 14,15 viene utilizzato per registrare contemporaneamente il neurone bersaglio e fornire i sostanze neuroattivi di interesse. È costituita da un elettrodo di registrazione collegato a una pipetta multibarrel che trasporta le sostanze neuroattivi. Modifiche del oProcedura riginal descritta da Havey e Caspary 14 sono state attuate. Ad esempio, un elettrodo di tungsteno, invece di un vetro, può essere utilizzato per registrare l&#39;attività neurale 16. Metodi precedentemente pubblicati per la fabbricazione di elettrodi di tungsteno 17,18 coinvolgono tre fasi generali: incisione elettrolitica di consigli filo di tungsteno, vetro isolante, e la regolazione dell&#39;esposizione punta a soddisfare i requisiti di registrazione. Un campo interessante ed emergente nel campo delle neuroscienze uditivo è lo studio di adattamento specifiche stimolo (SSA 19). SSA è una diminuzione specifica nella risposta neurale a suoni ripetitivi che non generalizzano ad altri suoni, raramente presentati. L&#39;importanza di SSA risiede nel suo ruolo potenziale di rilevamento devianza sottostante meccanismo neurale nel cervello uditivo, così come una possibile correlato neuronale per la componente tardiva disallineamento negatività uditivo potenziali evocati 20,21. SSA occurs dalla IC fino alla corteccia uditiva 19,22-24. GABA A inibizione mediata ha dimostrato di agire come un meccanismo di controllo di guadagno su SSA 7,16,25, che è stato anche dimostrato di essere colpiti da anestesia 26. Qui vi presentiamo un protocollo che combina i metodi descritti in precedenza per registrare l&#39;attività singola unità di neuroni IC prima e durante l&#39;applicazione di un antagonista selettivo dei recettori GABA A nei topi sveglio. In primo luogo, si descrive la fabbricazione di elettrodi piggy-back e il prossimo, i metodi chirurgici e di registrazione. Per verificare l&#39;efficacia di rilascio del farmaco, abbiamo confrontato campo recettivo così come il livello di SSA di neuroni IC prima e durante l&#39;espulsione microiontophoretic di gabazine.

<table><tbody><tr><td>Filo di tungsteno</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>33-0099</td><td>0,005 pollici x 3 pollici</td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosilicato&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>30-0053</td><td>Parete standard in borosilicato senza filamento, diametro esterno 1,5 mm, diametro interno 0,86 mm,</td></tr><tr><td>capillari in vetro multibarrel</td> lunghi 100 mm.<td>Strumenti di precisione mondiali</td><td>5B120F-4&nbsp;</td><td>Capillare a 5 barili, 4 pollici di lunghezza, 1,2 mm OD, con filamento</td></tr><tr><td>Diaplus</td><td>DiaDent</td><td>2001-2101</td><td>Adesivo fotopolimerizzabile, utilizzato per fissare l'elettrodo di tungsteno alla pipetta multibarile in vetro</td></tr><tr><td>G-Bond</td><td>GC Corporation</td><td>2277</td><td>Adesivo fotopolimerizzabile, utilizzato per fissare il palo della testa al cranio dell'animale</td></tr><tr><td>Charisma</td><td>Heraeus Kulzer</td><td>66000087</td><td>Composito fotopolimerizzabile, utilizzato per rafforzare il legame del palo con il cranio</td></tr><tr><td>Araldit Cristal</td><td>Ceys</td><td></td><td>2-component expoxy, utilizzato per garantire ulteriormente l'attacco dell'elettrodo di tungsteno alla pipetta multibarrel in vetro</td></tr><tr><td>Coperta riscaldante</td><td>Cibertec</td><td>RTC1</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>Narishige</td><td>SR-6N</td><td>Modificato per topi</td></tr><tr><td>Dispositivo microiontoforetico</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>Neurophore BH-2</td><td>Comprese le pompe per ionoforesi IP-2 (una per ogni canale di somministrazione del farmaco) e un modulo di bilancia</td></tr><tr><td>Estrattore per pipette in vetro multibarile</td><td>Narishige</td><td>Modello PE-21</td><td></td></tr><tr><td>Lampada LED</td><td>Technoflux</td><td>CV-215</td><td>5 W, 430-485 nm</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Ago in plastica flessibile, 34 AWG</td></tr><tr><td>Ketamina Imalgene</td><td>Merial</td><td></td><td>, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td></td><td>Xilazina, 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Gabazina / SR-95531</td><td>Sigma</td><td>S106</td><td>Preparare ~ 1000&micro; l di 20 mM di gabazina in acqua distillata e regolare il pH a 4</td></tr></tbody></table>

extracellulare la registrazione di un neurone attività combinata con microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi awake

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Le differenze dell&#39;attività di neurotrasmettitori e neuromodulatori, e di conseguenza diverse risposte neurali, si può rinvenire tra animali anestetizzati e sveglio. Pertanto, i metodi che consentono la manipolazione dei sistemi sinaptiche in animali svegli sono necessari al fine di determinare il contributo degli ingressi sinaptici al trattamento neuronale influenzata da anestetici. Qui, presentiamo metodologia per la realizzazione di elettrodi per registrare simultaneamente attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione in topi sveglio. Grazie alla combinazione di queste procedure, abbiamo effettuato iniezioni microiontophoretic di gabazine per bloccare selettivamente i recettori GABA A nei neuroni del collicolo inferiore di topi testa-trattenuto. Gabazine modificato con successo proprietà di risposta neurale come l&#39;area risposta in frequenza e l&#39;adattamento specifico per stimolo. Così, abbiamo dimostrato che i nostri metodi sono adatti per Recording attività singola unità e per sezionare il ruolo dei recettori del neurotrasmettitore specifici in elaborazione uditiva. La limitazione principale della procedura descritta è il tempo di registrazione relativamente breve (~ 3 ore), che è determinato dal livello di assuefazione dell&#39;animale alle sessioni di registrazione. D&#39;altro canto, più sessioni di registrazione possono essere eseguite nello stesso animale. Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altre procedure sperimentali utilizzate per manipolare il livello della neurotrasmissione o neuromodulation (come iniezioni sistemici o l&#39;uso di modelli optogenetic), è che l&#39;effetto del farmaco si limita agli ingressi sinaptici locali al neurone bersaglio. Inoltre, la misura fabbricazione di elettrodi permette la regolazione di parametri specifici in base alla struttura neurale e tipo di neurone di interesse (ad esempio la resistenza suggerimento per migliorare il rapporto segnale-rumore delle registrazioni).

Abbiamo registrato l&#39;attività singola unità di 4 neuroni ben isolate della IC. Tipici rapporti segnale-rumore ottenuti durante le registrazioni extracellulari in topi svegli sono mostrati in Figura 3B. Figura 4A mostra l&#39;area risposta in frequenza (FRA) di ogni neurone prima e durante il blocco del GABA A recettori con gabazine. È stato osservato un incremento nella forza risposta (picchi / stimolo) e un ampliamento della sintonizzazio...

Presentiamo metodi per la costruzione di elettrodi per registrare simultaneamente l'attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione nei topi svegli. Questa tecnica consente l'analisi dettagliata di input sinaptici locali putativi al neurone di interesse.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è manipolare l'impatto degli input sinaptici nell'elaborazione neuronale mediante iniezioni microiontoforetiche di sostanze neuroattive in animali svegli. Questo metodo può aiutare a chiarire funzionalità fondamentali dei sistemi sensoriali, come il ruolo dei neurotrasmettitori e le loro interazioni con gli stimoli sensoriali e la codifica neuronale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di manipolare gli input sinaptici locali nel bulbo olfattivo e di studiare i sistemi neuronali modulatori senza essere influenzati dall'anestesia.Sebbene questo prodigo sia stato utilizzato qui in topi immobilizzati, può essere impiegato anche in altri mammiferi come pipistrelli, ratti o criceti. Per iniziare questa procedura, posizionare i fili di tungsteno in uno strumento di allineamento appositamente costruito per il taglio. Fissare con cura le estremità libere dei fili con nastro adesivo e tagliarli alla lunghezza desiderata.Successivamente, tirare delicatamente il nastro per rimuovere i fili di tungsteno dallo strumento di allineamento, assicurandosi che tutti i fili rimangano attaccati al nastro. Arrotolare quindi il nastro su un mandrino in ottone lucidato e tenere i fili saldamente premuti contro il mandrino per garantire un buon contatto elettrico.In seguito, collegare l'ago a un motore da 5 giri/min nella stazione di lavoro. L'accesso dell'ago è inclinato di 45 gradi rispetto alla superficie della soluzione incisiva. Successivamente, immergere un terzo dei fili nella soluzione.Successivamente, immergere un elettrodo di grafite nel bagno di incisione per chiudere il circuito. Accendere la stazione di lavoro in modo che il mandrino inizi a ruotare, quindi regolare la corrente che passa attraverso gli elettrodi e la soluzione di incisione a 250 milliampere. Arrestare l'incisione della punta quando la corrente scende a 200 milliampere, al fine di intagliare le punte del filo in punti molto fini.Ora, inserire un filo in una capillare di vetro borosilicato con l'estremità inferiore ostruita con argilla modellabile. Tenere la pipetta utilizzando una bobina riscaldante e un pistone sospeso. Fissare il filo rivestito di vetro a un vetrino prima di posizionarlo sotto il microscopio.Posizionare la punta e toccare la perla di acido borico mettendola a fuoco. Quindi riscaldare la perla fino a quando fonde leggermente. Successivamente, inserire circa da 10 a 15 micron della punta del filo e spegnere i potenziometri di riscaldamento.Mentre la perla si raffredda, rimuovere il vetro dalla punta dell'elettrodo per esporre il tungsteno. Per ottenere una punta di circa 15 millimetri, impostare il polar sui parametri appropriati. Tirare la capillare per ottenere due pipette con la punta isolata.Montare una pipetta polare su un vetrino utilizzando argilla modellabile e romperne la punta usando forbici fini, pinzette o il lato piatto di un bisturi. Regolare leggermente l'angolo tra l'elettrodo e il multi-canale per ottenere un migliore collegamento e un insieme più sottile. Sotto il microscopio, allineare con attenzione l'elettrodo al tungsteno sulla punta del multi-canale.Dopo l'allineamento, abbassare l'elettrodo fino al contatto con il multi-barile. Inserendolo nella scanalatura tra i due barili superiori, far scorrere la punta dell'elettrodo fino a farla sporgere di 15-20 micrometri rispetto alla punta del multi-barile. Applicare ora una piccola goccia di adesivo polimerizzabile alla luce sul tungsteno e sul complesso del multi-barile, a circa 5 millimetri dalle loro punte.Evitare che la colla raggiunga le punte per non ostruire i canali multicanale e indurire la colla utilizzando una lampada a LED con luce blu. Ora, posizionare l'animale anestetizzato su una coperta riscaldata per mantenere la temperatura a 38 gradi celsius e stabilizzare la testa dell'animale in un telaio stereotassico con due barre auricolari e una barra per il morso. Applicare quindi un gel oftalmico per proteggere gli occhi. Successivamente, rasare il cuoio capelluto e applicare iodopovidone per disinfettare la pelle. Utilizzando un bisturi, praticare un'incisione lungo la linea mediana per esporre il cranio e ritrarre il periostio che ricopre le ossa parietali e la parte più rostrale delle ossa occipitali.Successivamente, applicare uno strato sottile di adesivo polimerizzabile alla luce sul cranio e alla base del supporto per la testa. Attendere 10 secondi e posizionare il supporto per la testa sulla regione rostrale dei parietali lungo la linea mediana. Utilizzare una sorgente di luce blu per polimerizzare l'adesivo per 20 secondi al fine di ottenere una resistenza efficace dell'incollaggio.Successivamente, praticare due fori intorno e dietro la base del supporto per la testa utilizzando una piccola punta da trapano. Inserire una vite di tipo orologiero in un foro praticato, in modo da creare un punto di contatto aggiuntivo tra il cranio e la struttura di fissaggio della testa. Effettuare un giro e mezzo per avvitare saldamente le viti e verificare con una pinzetta che non siano allentate.Inserire quindi la punta del filo di collegamento a massa in argento nella terza foratura e assicurarsi che entri in contatto con la dura madre. Applicare una piccola goccia di colla cianoacrilica resistente all'acqua per fissare il filo al cranio. Successivamente, applicare un composito fotopolimerizzabile per rinforzare l'adesione del supporto cranico al cranio, ricoprendo la base del supporto, la parte inferiore del filo in argento e le viti.Attenzione a non estendersi oltre il lambda per consentire l'accesso durante la registrazione e polimerizzare il composito utilizzando una sorgente di luce blu. Successivamente, ritrarre il muscolo nella parte posteriore del collo vicino al suo punto di inserzione sul cranio. Utilizzando una piccola trapanazione, praticare una finestra rotonda appena al di sotto della sutura lambda e laterale rispetto alla linea mediana per esporre il collicolo inferiore.In questa procedura, posizionare il corpo dell'animale in un sostegno appositamente progettato con imbottitura in schiuma. Fissare il supporto della testa a un attacco collegato al telaio stereotassico. Questo è un buon momento per somministrare all'animale una ricompensa liquida.Successivamente, coprire il corpo dell'animale con una coperta di cotone e fissarla in modo lento utilizzando un emicilindro di plastica e del nastro adesivo. Utilizzare una siringa con un'estremità flessibile per riempire i barili con i farmaci scelti. Con l'aiuto del micromanipolatore, posizionare l'elettrodo multibarile sul suo supporto.Successivamente, inserire un filo di argento non codificato all'interno di ogni canna in modo che un'estremità entri in contatto con la soluzione e l'altra estremità sia accessibile. Quindi collegare tali estremità al dispositivo di microiontoforesi. Dopo di ciò, collegare il terminale positivo all'estremità dell'elettrodo al tungsteno e il terminale di massa al filo di argento che entra in contatto con la dura madre.Successivamente, spostare l'elettrodo multicanale fino a quando la punta entra in contatto con la superficie del cervello. Applicare soluzione salina sterile calda per prevenire l'essiccamento del tessuto cerebrale. A questo punto, applicare una corrente di ritenzione per evitare la fuoriuscita del farmaco dalla punta del canale mentre si ricerca l'attività di unità singole.Registra l'attività neurale e l'applicazione iontoforetica di gabazina. Qui è mostrata l'area di risposta in frequenza di quattro neuroni registrati nel collicolo inferiore prima e durante l'iniezione micro iontoforetica di gabazina. Le croci nere indicano le frequenze scelte per essere presentate come suoni rari e ripetitivi.Di seguito sono riportati gli istogrammi cumulativi di tempo peristimolo della risposta neuronale a tutte le frequenze e intensità presentate per costruire l'area di risposta, prima e durante l'iniezione di gabazina. Le barre nere indicano la durata del suono. Sono inoltre mostrati i diagrammi puntiformi delle risposte di scarica a una coppia di frequenze presentate come stimolo raro in rosso e stimolo ripetitivo in blu, prima e durante l'applicazione di gabazina.Lo sfondo ombreggiato indica la durata dello stimolo. Questi raster puntiformi mostrano le risposte quando le probabilità relative delle parafrequenze sono state invertite. Questo grafico mostra le risposte di un singolo neurone a sette coppie di frequenze presentate come suono raro e ripetitivo prima e durante l'applicazione di gabazina.E questo grafico mostra gli indici SSA della risposta neurale a suoni rari e ripetitivi misurati prima e durante l'applicazione di gabazina. Una volta padroneggiata, la procedura descritta permette l'adeguamento dei parametri specifici in base alla struttura neurale e al tipo di neurone di interesse. Quando si tentano registrazioni con immobilizzazione della testa dell'animale, è fondamentale ricordare che la durata delle registrazioni è determinata e limitata dal livello di abituazione dell'animale, ma un vantaggio importante è che possono essere effettuate più incisioni di registrazione sullo stesso animale in diversi giorni, riducendo al minimo il numero di animali utilizzati.Eseguendo microiontoforesi mediante elettrodi a dorso di porco, è possibile combinare altre procedure, come iniezioni di transistor neurali, al fine di rispondere a ulteriori domande riguardo alla provenienza degli input e alla destinazione delle proiezioni dei neuroni all'interno del sito di registrazione. Un aspetto critico quando si lavora con animali svegli è il loro benessere; pertanto, non superare mai la durata massima di tempo di richiamo approvata nel proprio protocollo e monitorare costantemente la comparsa di eventuali segni di disagio. In tal caso, è necessario interrompere immediatamente la registrazione.

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Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

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