鼠标冠状动脉内皮细胞的分离

本实验的总体目标是获得大量高度纯化的高质量小鼠冠状动脉内皮细胞。这种方法可以帮助回答心血管研究领域的关键问题。该技术的主要优点是它有助于获得高产量的优质内皮细胞。

演示该程序的将是研究专家 Shizhen Luo 和我们的首席研究员 Ayako Makino 博士。在手术前一周，将 1 毫升 CD31 缓冲液添加到每个样品的 1.5 毫升微量离心管中。接下来，将绵羊抗辐射 IGG 珠子与温和的移液混合，并向每个试管中加入适当体积的珠子。

加入所有珠子后，用力摇动试管 30 次，然后将它们放在磁板上摇动 1 分钟。然后，在试管仍连接到板上的情况下，丢弃缓冲液并向每个试管中加入 1 毫升新鲜的 CD31 缓冲液。加入 2 微升 rad 抗小鼠 CD31 抗体，并将试管放在 4 摄氏度的旋转器上过夜。

第二天，将试管转移到层流罩下，然后将它们放回磁板上，摇动 1 分钟。然后用 1 毫升新鲜的 CD31 缓冲液替换上清液，用手剧烈摇动试管 30 次。第三次洗涤后，在 4 摄氏度下将试管放回旋转器。

在手术当天，首先向实验动物腹膜内注射 0.1 毫升肝素以防止血液凝固。十分钟后，注射 0.01 毫升戊巴比妥麻醉小鼠。然后，确认对脚趾捏合没有反应。

将心脏和肺组织一起取出后，将它们放入装有 Krebs 缓冲液的烧杯中，轻轻摇晃冲洗组织。然后将组织转移到一个装有新鲜 Krebs 的 6 厘米培养皿中，并使用剪刀和前额去除肺叶。现在将一根 20 号导管插入主动脉，并用补充肝素的 HBSS 冲洗冠状动脉循环系统。

当所有血液都被去除后，在心室做一个小切口，轻轻摇晃冲洗心脏，然后将心脏组织放入冰上的样本管中。消化组织以释放冠状动脉内皮细胞后，用 5 毫升洗涤缓冲液沉淀并洗涤细胞两次。然后将一管先前制备的珠子放在磁板上，摇动管子 3 次以使珠子均匀分布。

第二次洗涤后，在不破坏沉淀的情况下去除尽可能多的上清液，并将细胞与剧烈的轻弹相关联。接下来，将细胞重悬于一毫升洗涤缓冲液中，轻轻混合，并从珠子中丢弃 CD31 缓冲液。将细胞与珠子混合，轻弹试管 30 次。

然后将细胞和微珠溶液在 4 摄氏度下放在旋转器上 30 分钟。在细胞孵育时，用明胶溶液包被每个样品的一个电镀室表面，并将腔室置于 37 摄氏度下 30 分钟。当明胶凝固后，去除任何多余的凝胶溶液并干燥腔室表面。

然后将磁珠偶联细胞转移到通风橱下的磁板上振荡 2 分钟，并丢弃洗涤缓冲液。向细胞中加入 1 毫升新鲜洗涤缓冲液，从板中取出试管，剧烈摇晃 30 次，然后轻弹 30 次。将试管放回板中再摇动一分钟。

最后一次搅拌后，将试管放回磁板上进行最后一分钟的摇动，并用 1 毫升 37 摄氏度的内皮细胞培养基替换洗涤缓冲液，并补充有 20% 的铁强化小牛血清。最后摇晃并轻弹试管 30 次。然后使用设置为 500 微升的 1 毫升移液器搅动共轭细胞 10 次，并将 500 微升等分试样的冠状动脉内皮细胞转移到每个电镀室孔中，在 37 摄氏度下孵育过夜。

第二天，在补充有 10% FBS 的内皮细胞培养基中洗涤细胞。通过这种方法分离的冠状动脉内皮细胞的纯度可以通过针对内皮细胞表面标志物、BS 凝集素和 AC LDL 的免疫组织化学染色来确认，超过 90% 的细胞在典型的小鼠冠状动脉内皮细胞培养物中表现出两种标志物的双重阳性表达。按照此程序，作为一种方法，可以进行各种血液、免疫接收和荧光成像来回答其他问题，例如在不同疾病状态下可以修饰哪些蛋白质。

开发后，该技术为研究人员将研究扩展到冠状动脉内皮细胞领域提供了必要的工具。看完这个视频，你应该对如何分离出高数量、高质量的小鼠冠状动脉内皮细胞有了很好的了解。在此过程中有几个关键点。

最重要的是在整个隔离过程中保持无菌环境。其次是尽快完全冲洗血液，以避免毛细血管网络中的血液凝固。第三种是测量所有缓冲液的 pH 值，尤其是 CD31 缓冲液。