הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח
15 ביוני 2016
פרוטוקול זה מתאר צעדים פרוצדורליים בסיסיים לביצוע הקלטות תיקון- clamp כל תא. טכניקה זו מאפשרת חקר ההתנהגות החשמלית של נוירונים, וכאשר ביצע פרוסות המוח, מאפשר הערכה של פונקציות עצביים שונים מתא עצב שעדיין משולבים מעגלים במוח השתמרות טוב יחסית.
המטרה הכללית של הליך זה היא לתאר כיצד לבצע הקלטות patch-clamp של תא שלם (whole-cell) בנתחים של מוח שחולקו לאחרונה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון כיצד מניפולציות של בקרה ניסויית משנות את פעילותם של נוירונים ספציפיים באזורי מוח ספציפיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת את האמצעי לזיהוי שינויים ארוכי טווח בתפקודי נוירונים שהתפתחו בבעלי חיים ערים ושלמים בתוך הכנה ex vivo.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקודי נוירונים בחתכים של מוח, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון תאים בתרבית ונוירונים in vivo. את הפרוצדורה ידגים פרנסיסקו גרסיה-אוסקוס, סטודנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, בעזרת פיפט העברה מפלסטיק עם קצה חתוך, שאבו בעדינות פלח מוח אחד מתא ההתאוששות.
הנח את פיפט ההעברה בתא ההקלטה, וסגור בעדינות את הפיפט כדי להוציא את הפרוסה אל על לביגסית (cover slip) המניחה בתחתית התא. לאחר מכן, באמצעות עדשת אובייקטיב 4x של המיקרוסקופ, מקם את הפרוסה כך שהאזור הרצוי ימוקם בדיוק במרכז תא ההקלטה. לאחר שהושג המיקום הרצוי, קבע את מיקום פרוסת המוח באמצעות תפס הפרוסה (slice hold down), הידוע גם כנבל (harp).
לאחר מכן, עברו לעדשה של 40x, והורידו את העדשה בעדינות עד שתבוא במגע עם ה-ACSF בתא. לאחר מכן, השתמשו בגלגל הכיוון העדין כדי להביא את הרקמה לפוקוס. כאשר הפוקוס נמצא בגובה הרקמה, צפו בתאים באזור המטרה.
כעת, חפשו תא מטרה. סמנו אותו על מסך המחשב כדי לסייע בהכוונת מיקרופיפטת ההקלטה. הסירו את עדשת העדשה כדי לאפשר מספיק מקום להצבת מיקרופיפטת ההקלטה.
בשלב זה, באמצעות מזרק של 1 ml, מחט מיקרו-מזרק שאינה מתכתית ומסנן ייעודי, מלאו מיקרופיפט בתוספת של התמיסה הפנימית שהוכנה מראש. ודאו כי אין בועות אוויר במיקרופיפט. לאחר מכן, מקמו את המיקרופיפט במחזיק אלקטרודות, כך שהתמיסה תבוא במגע עם אלקטרודת התיל המצופה בכסוף כלוריד.
הדק את מכסה הפער, כך ששייבת החרוט תצור איטום סביב המיקרו-פיפטה. לאחר מכן, הפעל לחץ חיובי באמצעות מזרק מלא באוויר המחובר למחזיק הפיפטה לפני טבילת המיקרו-פיפטה ב-ACSF, כדי למנוע חדירה של שובבים פנימה. באמצעות המיקרו-מניפולטור, הנח את הפיפטה למטה אל התא, כך שתהיה בקירוב מתחת למרכז העדשה הטבולה.
בעודכם מניעים את המיקרופיפט באמצעות המיקרו-מניפולטור במהירות בינונית עד גבוהה, אתרו את המיקרופיפט על מסך המחשב והנחיתו את המיקרופיפט לעבר מיקום התא על ציר ה-XY. במקביל, מדדו את התנגדות המיקרופיפט על ידי הפעלת מדרגת מתח (voltage step). הפעילו לחץ חיובי כדי להסיר בועות אוויר או גופים זרים אחרים החוסמים את המיקרופיפט.
לאחר ניקוי המיקרופיפטה, בצעו כיול מתח (voltage offset) כדי להפחית את זרם הפיפטה לאפס. בעזרת גלגל המיקוד העדין של המיקרוסקופ, התחילו במיקוד כלפי מטה תוך הורדה הדרגתית של המיקרופיפטה. תמיד יש לבצע תחילה מיקוד כלפי מטה ולאחר מכן להוריד את המיקרופיפטה למישור המיקוד, כדי להבטיח שקצה המיקרופיפטה לא יחדור בפתאומיות אל תוך הפרוסה.
כאשר המיקרופיפטה באה במגע עם פני השريחה, הפחית את מהירות המיקרו-מניפולטור למצב בינוני-נמוך. הפעל בעדינות לחץ חיובי קל כדי לנקות שאריות בנתיב. לאחר מכן, התקרב לתא, בין אם על ידי תפעול לסירוגין של כפתורי הבקרה של ציר XYZ, ובין אם על ידי התקרבות אלכסונית שבה שני הצירים XZ משתנים עם סיבוב של כפתור ציר Z.
כאשר המיקרופיפטה קרובה מספיק לתא, תופיע שקע (dimple) על פני השטח של התא. כעת יש להפעיל שאיבה חלשה וקצרה דרך הצינור המחובר לצינור השאיבה של מחזיק הפיפטה כדי ליצור אטימה. בזמן שנוצר ה-giga-seal, השתמש במגבר המופעל על ידי מחשב כדי להביא את פוטנציאל האחזקה של התאים לפוטנציאל המנוחה הפיזיולוגי, וזאת כדי למנוע שינויים פתאומיים ברגע שייקרע ממברנה.
לאחר שנוצר ה-giga-seal, פצה על קיבולים (capacitations) מהירים או איטיים. בשלב זה חשוב מאוד שהשאיבה המופעלת לא תהיה חזקה מדי, שכן אחרת הממברנה עלולה להיקרע לפני כינון האטום.
אם האטם נותר יציב ומעל ג'יגה-אוהם אחד, יש להפעיל שאיבה קצרה וחזקה כדי לפרוץ את ממבנה הפלסמה. השאיבה חייבת להיות קצרה וחזקה יותר מהלחץ שהופעל בעת יצירת האטם. זאת כדי לפרוץ את הממברנה כראוי, ולהגיע לתצורה יציבה של תא שלם (whole-cell configuration).
עברו למצב תא בבדיקת הממברנה, כדי לצפות בפרמטרים שונים של התא, כגון התנגדות קלט, התנגדות טורית וקיבול ממברנה. לאחר השגת קונפיגורציית תא שלם (whole-cell), המשיכו לנטר פרמטרים אלו במהלך ההקלטה. מוצג כאן דוגמה לשיפוע EPSCs שהושרה מ-MSN בודד מהמעטפת של הגרעין האקומבנס (nucleus accumbens shell).
העלאת הטמפרטורה מ-24 ל-28 ועד ל-32 מעלות צלזיוס מגבירה את השיפוע של EPSCs מעוררים. כאן, אמפליטודת ה-EPSCs המעוררים מוערכת במצב voltage clamp במינוס 80 מיליוולט. כאשר התנגדות הטור (series resistance) עולה, אמפליטודת ה-EPSCS המעוררים פוחתת.
וכאן, דוגמה לעקבות משני נוירונים המראים את השפעת התנגדות הכניסה על יכולת הנוירון להפיק ספייקים. הנוירונים נמצאים תחת בקרת זרם (current clamp) ומוחזקים ב-80- millivolts. כאשר התנגדות הכניסה עולה, גובר גם מספר פוטנציאלי הפעולה.
במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שהפקת פרוסות מוח בריאות היא קריטית. חשוב גם לנטר את הפרמטרים העשויים להשפיע על צורת גל האות החשמלי, כגון התנגדות טורית (series resistance), התנגדות כניסה והטמפרטורה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לכם הבנה טובה של ההיבטים הבסיסיים של טכניקת הקלטת תא שלם (whole-cell recording) בפרוסות מוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השלבים לביצוע הקלטות patch-clamp בתצורת whole-cell בתוך פרוסות מוח שנותחו לאחרונה. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את ההתנהגות החשמלית של נוירונים ולהעריך תפקודי נוירונים שונים בתוך מעגלים מוחיים שלמים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- הקלטות patch-clamp של תא שלם הן חיוניות להבנת הפעילות הנוירונלית.
- ניתן ליישם שיטה זו על פרוסות מוח, תאים בתרבית ונוירונים in vivo.
- היא מאפשרת לבחון כיצד מניפולציות משפיעות על נוירונים ספציפיים.
מטרת המחקר
- להדגמת הפרוצדורה להקלטות patch-clamp של תא שלם.
- לבחינת תפקודים עצביים בחתכי מוח.
- לספק תובנות לגבי שינויים ארוכי טווח בתפקודי נוירונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה של פרוסות מוח מתאי ההתאוששות.
- שימוש בפיפטת העברה פלסטית עם קצה מקוצץ לטיפול בפרוסות.
- ביצוע מניפולציות של בקרת ניסוי.
- הקלטה של פעילות חשמלית של נוירונים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי דפוסי פעילות נוירונלית בחתכי מוח.
- הערכה של האופן שבו מניפולציות ספציפיות משנות את תפקודי הנוירונים.
- תובנות לגבי האינטגרציה של נוירונים בתוך מעגלי מוח.
מסקנות
- הקלטות patch-clamp של התא השלם הן כלי רב עוצמה במדעי העצבים.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של התנהגות נוירונלית במערכות שלמות.
- ניתן להתאימה למערכי ניסוי שונים מעבר לפרוסות מוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הקלטות patch-clamp של תא שלם בחתכי מוח מאפשרות מדידה מדויקת של תכונות חשמליות נוירונליות בהקשר רלוונטי פיזיולוגית, ובכך תומכות בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). טכניקה זו מספקת נתונים ברמת דיוק גבוהה על האופן שבו מניפולציות פרמקולוגיות או גנטיות משנות את התפקוד הנוירונלי, ובכך תורמת ישירות לתיקוף המטרה ולביטחון החזוי בפיתוח תרכובות נוירו-אקטיביות. הגישה של ה-ex vivo מגשרת על הפער בין בדיקות in vitro למודלים in vivo, ובכך מחזקת את הרצף התרגומי לאורך תהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה ישירה של התגובה הנוירונלית לתרכובות מועמדות או למודיפיקציות גנטיות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות כימות שינויים בתכונות סינפטיות ואינטרינזיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד התאמות נוירונליות ספציפיות בעקבות מניפולציות ניסוייות.
- מעניק ביטחון חיזוי לקידום מטרות בעלות חתימות אלקטרופיזיולוגיות חזקות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס הכנות מאומתות של פרוסות מוח לצורך סריקה פרמקולוגית בהמשך.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, כגון התנגדות קלט (input resistance), התנגדות טורית (series resistance) וזרמים סינפטיים מעוררים.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך השוואות בין מחקרים שונים ובין תרכובות שונות.
- תומך בהערכה מהימנה של השפעות תרכובות על עירור נוירונלי והעברה סינפטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים ex vivo לבין נוירו-אדפטציות in vivo, ובכך תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מספק המשכיות משלבי מניפולציות בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנוני CNS.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון המבוססות על תגובות נוירונליות רלוונטיות פיזיולוגית.
- תומך בזיהוי שינויים נוירונליים ארוכי טווח הרלוונטיים למחלה או להתערבות טיפולית.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
טכניקת patch-clamp של תא שלם בפרוסות מוח ממוקמת בין שלב הגילוי המוקדם לבין התיקוף הפרה-קליני, ומאפשרת מחקרים מכניסטיים התורמים הן לבחירת המטרה והן לאופטימיזציה של תרופות מובילות בקווי פיתוח של תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בחינת השערות על תפקוד נוירונלי ועל מודולציה של מסלולים בעקבות התערבויות ניסוייות.
- סריקה: מספקת פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות ברזולוציה גבוהה של תכונות סינפטיות ונוירונליות אינהרנטיות לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין תובנות מכניסטיות ex vivo לבין התאמות עצביות in vivo, ובכך תומכת בהלימה של ביומרקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לצורך תיקוף מטרות ב-CNS ואפיון תרכובות במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מאפשר ביצוע של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים תפקודיים חזקים בשלבים מוקדמים של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדירת עדיפויות מותאמת סיכון ובקידום של תוכניות CNS בהתבסס על תוצאות תפקודיות של נוירונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות והכשרה בתחום האלקטרופיזיולוגיה לצורך רכישת נתונים מהימנה.
- דורש מכשור מדויק, הכולל מגברי patch-clamp ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדת בין צוותים שונים לגבי הכנת הפרוסות ופרמטרי ההקלטה.
- התאמה לאזורי מוח שונים או למינים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- איכות הנתונים רגישה לבריאות הפרוסה, לבקרת הטמפרטורה ולניטור ההתנגדות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Slice Placement and Visualization
2:15
Micropipette Placement and Positioning
3:45
Final Approach, Seal Formation, and Obtaining the Whole-cell Configuration
5:56
Results: Effect of Temperature, Series Resistance, and Input Resistance on the Waveform of the Electrical Signal
6:47
Conclusion
