במודל עכבר של רשתית איסכמיה reperfusion נזק ע"י העלאת רמת הלחץ התוך עיני

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לספק מודל ניסויי של פגיעה רשתית מסוג איסכמיה-רפרפוזיה (Retinal Ischemia-Reperfusion Injury), והשלכותיה הפתולוגיות. שיטה זו משמשת באופן נפוץ לחקר המנגנונים העומדים בבסיס איסכמיה-רפרפוזיה רשתית, וכן להערכת גישות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בפתולוגיות נלוות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא יוצרת פגיעה המכוונת באופן ממוקד למבני העין, תוך גרימת נזק מינימלי לרקמות הסובבות.

התועלת של טכניקה זו משתרעת להבנה ואפיון של ביטויים מרובים של פגיעת איסכמיה-reperfusion ברשתית, הכוללים: דלקת, עקה חמצונית ותפקוד לקוי של תאי תמיכה ביחידה הנוירו-וסקולרית של הרשתית. הדגמה בווידאו של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהטכניקות הכירורגיות להחדרת הקנולה עשויות להיות קשות לשחזור ללא מדריך ויזואלי. לפני תחילת הפרוצדורה, חממו כלוב ריק על השולחן.

לאחר מכן, הכניסו את הקצה החד של צינור ה-Y-site שנקדח מראש מהסט הראשוני לתוך בקבוק של 0.1% Heparin sodium, ותלו את תחתית ה-Heparin sodium מתושבת של מוט עירוי. פתחו בלחיצה את מכסה מסנן האוויר שעל הצינור. לאחר מכן, הגביהו את בקבוק ה-Heparin sodium לגובה של 163 centimeters מהשולחן ועד לשיא של טפטוף ה-sodium Heparin, כדי ליצור לחץ זרימה של Heparin sodium של 120 mililiters of mercury.

פתחו את הצינורית של הסט הראשוני עם נקודת ה-Y חרושה מראש, כדי לאפשר ל-Heparin sodium למלא את הצינורית, וחברו את הצינורית של הסט הראשוני עם נקודת ה-Y חרושה מראש למניפולד בעל חמישה שסתומים. לאחר מכן, באמצעות מחברי צינור Luer male ל-Luer male, חברו מחטים בכילור 30 gauge ובאורך half-inch למניפולד בעל חמישה פתחים. הכניסו כל אחת מהמחטים למקטע נפרד באורך ten inch של צינורית בכילור 30 gauge.

לאחר מכן, בעזרת פינצטות העצרה (hemostats), שברו קצוות של מחטים חדשות מדגם 30 gauge באורך חצי אינץ', והחדירו את קצותיהן הקהות לקצוות הפתוחים של הפיתוליות מדגם 30 gauge. לאחר מכן, השתמשו בסרט דביק כדי לסדר את צינורות המחט כך שהצינורות המחוברים לפתחים הפנימיים ימוקמו מעל הצינורות המחוברים לפתחים החיצוניים, כדי למנוע הסתבכות של הפיתוליות במהלך הקניולציה של התא הקדמי (Anterior Chamber Cannulation). כעת, הפעילו את זרימת ה-0.1% Heparin sodium אל סבב השסתומים (manifold) בן חמשת השסתומים ואל כל פתח בנפרד למשך שתיים עד שלוש דקות כדי להוציא בועות אוויר.

לאחר מכן, סגרו את כל הפתחים במניפולטור של חמישה שסתומים. לביצוע הקניולציה, לאחר מתן ההרדמה, הניחו את כל העכברים בכלוב המחומם על שולחן הניתוח, ואשרו את הגעתם להרדמה עמוקה על ידי היעדר תגובה לצביטה בבהו הבוהן לאחר חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, טפטפו טיפה אחת של Tropicamide להרחבת האישונים וטיפה אחת של Proparacaine להרדמה מקומית לכל אחת מעיני בעלי החיים, וסדרו את העכברים לפי סדר ההרדמה, כך שהעכבר הראשון שהורדם יהיה העכבר הראשון שיעבור קניולציה.

בזמן ההמתנה להשפעת טיפות העיניים, הכינו רצועות דבק ישרות באורך של ארבעה אינצ'ים, תוך מתיחה חזקה של הדבק לפני הקריעה, והפרישו רצועת דבק אחת לכל בעל חיים. שימו לב כי אי-מתיחה חזקה של הדבק תגרום להתכווצותו. כאשר העכבר הראשון מוכן, הניחו את בעל החיים תחת מיקרוסקופ כירורגי.

לאחר מכן, פתח את הפורט הראשון של 0.1%Heparin sodium במניפולד בעל חמישה שסתומים, והשתמש בפינצטה כדי להבליט בעדינות עין אחת. לאחר מכן, הכנס את מחט הקנולה בגודל 30 gauge לתוך התא הקדמי, בערך במחצית הדרך בין הסיבים הזונולריים לבין קודקוד הקרנית. יש להיזהר כדי למנוע חדירה שנייה לקרנית.

שימו לב כי נעשה שימוש בתנועת סיבוב עדינה כדי להחדיר את הקנולה עמוק אל תוך הלשכה הקדמית. כעת, לחצו את הצינור בכיול 30 gauge אל שולחן העבודה כדי למזער כל תזוזה של הקנולה המוחדרת בזמן ההגעה לסרט דביק, והשתמשו בסרט כדי לקבע את הצינור לשולחן. לאחר קיבוע הצינור, רשמו את זמן תחילת הניתוח.

השתמשו במיקרוסקופ כדי לוודא שאין דליפה, ושהעין שעברה Ischemia-Reperfusion גדולה יותר מהעין הנגדית, כדי לאשר את קיומה של התנפחות עינית. לאחר מכן, מרחו Hypromellose בשתי העיניים מדי 30 דקות עד לסיום הניסוי כדי לשמן את הקרנית ולאטום דליפות מיקרוסקופיות. במידה והחיה נעה במהלך הפרוצדורה, הרימו את הזנב והחדירו מנת דחף של Ketamine באופן אינטraperitoneally.

90 דקות לאחר קנולציה של החיה הראשונה, משוך בעדינות את הקנולה מהתא הקדמי, ושמן את שתי העיניים בג'ל סיכוך. ככל שקנולות נוספות מוסרות, החזר כל עכבר לכלוב שעל שולחן הניתוחים, עד שהחיות יחלימו לחלוטין. לאחר הסרת כל הקנולות, חטא אותן באמצעות מגבונים אלכוהוליים.

לאחר מכן, השתמש במזרק של 60 milliliter מלא באוויר כדי לדחוף את ה-Heparin sodium מתוך סבון השסתומים בעל חמשת הפתחים, מחטים בכילוג 30, צינוריות בכילוג 30 וקנולות. לאחר מכן, שטוף את כל המכשירים באמצעות מזרק של 60 milliliter מלא במים מזוקקים. לבסוף, דחף את המים המזוקקים מכל החומרים באמצעות 60 milliliter של אוויר, ואחסן את הציוד שעבר חיטוי ושטיפה לשימוש מאוחר יותר.

סימון אימונוהיסטוכימי של NeuN בגרעיני תאי עצב חושף אובדן משמעותי של תאי עצב בעקבות פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה, כפי שנראה בדימוי מיקרוסקופי קונפוקלי שבעה ימים לאחר פגיעת איסכמיה-רפרפוזיה. ואכן, כימות ידני של תאים חיוביים ל-NeuN בעיניים של קבוצת הביקורת ובעיניים לאחר איסכמיה-רפרפוזיה, מדגים ירידה במספר הנוירונים בשכבת תאי הגנגליון לאחר הפגיעה, מה שמעיד על קיומו של מוות תאי המושרה על ידי איסכמיה-רפרפוזיה. אמפליטודות נמוכות יותר של גל-a וגל-b שתועדו באמצעות אלקטרו-רטינוגרפיה מעידות אף הן על התרחשות ליקויים בתפקוד הנוירונלי של הרשתית המושרים על ידי איסכמיה-רפרפוזיה, בהשוואה לעיני ביקורת שאינן פגועות.

לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בעשרה בעלי חיים תוך כחמש שעות, כולל השעתיים האחרונות המוקדשות להמתנת התאוששות העכברים מההרדמה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על הרדמה עמוקה, שכן סדציה יעילה תמנע תזוזה של הקנולה כתוצאה מתנועת בעל החיים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אלקטרו-רטינוגרפיה, כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע לתפקוד הרשתית. טכניקה זו אפשרה לחוקרים בתחומי נוירו-אופתלמולוגיה וביולוגיה וסקולרית לחקור פתוגנזה נוירו-וסקולרית של הרשתית והתערבויות טיפוליות במכרסמים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד ליצור פגיעה ממוקדת ברשתית באמצעות קנולציה של הלשכה הקדמית של העין.

אל תשכחו כי עבודה עם מכשירים כירורגיים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון שימוש במיכל יעיל להשלכת חפצים חדים, בעת ביצוע פרוצדורה זו.