Strategico cellule endoteliali tubo saggio Formazione: Confronto tra matrice extracellulare e fattore di crescita ridotto matrice extracellulare

L'obiettivo generale di questo esperimento è quantificare la dipendenza dalla formazione di tubi cellulari endoteliali da chemochine angiogeniche utilizzando due diverse matrici extracellulari che contengono componenti che si associano a varie molecole angiogeniche. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo dell'angiogenesi del cancro, come ad esempio, perché l'angiogenesi si supporta con percorsi alternativi utilizzando alterazioni nella matrice extracellulare? I principali vantaggi di questa tecnica è che è quantificabile e utilizza meno variabili.

A dimostrare la procedura sarà la signorina Donghong Ju, ricercatrice associata al laboratorio. Per iniziare questa procedura, scongelare la matrice extracellulare GFR o la matrice extracellulare normale, durante la notte a quattro gradi Celsius. Conservare la piastra di coltura a 96 pozzetti sul ghiaccio e aggiungere 50 microlitri di matrice extracellulare refrigerata per pozzetto utilizzando puntali per pipette pre-raffreddati.

Preparare triplicati di cinque pozzetti contenenti solo la matrice extracellulare normale, seguiti da triplicati di cinque pozzetti contenenti solo matrice extracellulare GFR. Quindi, incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, lavare l'HUVEC una volta con PBS, senza calcio e magnesio, e aggiungere un millilitro di 05% di tripsina EDTA.

Successivamente, incubare le cellule a 37 gradi Celsius per uno o cinque minuti e controllarle ogni minuto fino a quando la maggior parte delle cellule non si arrotonda. Quindi, rimuovere le celle picchiettando il pallone. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di terreno basale con l'uno percento di FBS al pallone.

Trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri. Quindi, centrifugare le celle a 200 volte G per cinque minuti. Dopo cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule con due millilitri di terreno basale.

Contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare da due a tre volte da 10 a una quinta cellula per millilitro. Quindi, preparare 100 microlitri di cinque diverse concentrazioni 10X dell'inibitore CXCR2 in terreno basale. Pipettare 300 microlitri della sospensione HUVEC in ciascuna delle cinque provette per microcentrifuga singole.

Successivamente, aggiungere 33 microlitri dell'inibitore 10X di ogni concentrazione nelle provette contenenti HUVEC e agitarle. Successivamente, pipettare 50 microlitri di ciascuna delle sospensioni cellulari in pozzetti individuali della matrice extracellulare. Piastra ogni sospensione in triplice copia e incuba per quattro-16 ore a 37 gradi Celsius.

Successivamente, scatta quattro foto per pozzetto utilizzando una fotocamera per microscopio invertito. In questa procedura, preparare la matrice extracellulare e le piastre secondo le stesse specifiche del saggio di formazione del tubo. Successivamente, preparare la sospensione di HUVEC e aliquotare in una piastra a 96 pozzetti contenente la matrice extracellulare a 50 microlitri per pozzetto.

Successivamente, far crescere le cellule sulla matrice extracellulare per quattro ore a 37 gradi Celsius. Quindi, scatta immagini prima dell'inizio del trattamento farmacologico. Successivamente, preparare cinque diverse concentrazioni di due X dell'inibitore CXCR2 in terreno basale.

Aggiungere 50 microlitri di inibitore CXCR2 di ogni concentrazione a ciascuno dei 96 pozzetti contenenti HUVEC. Successivamente, incubare la piastra per altre due-12 ore a 37 gradi Celsius. Quindi, scatta quattro immagini di ciascun pozzetto utilizzando una fotocamera per microscopio invertito.

Per valutare la formazione del tubo catturata nelle immagini, misurare la lunghezza totale del tubo in quattro campi microscopici casuali utilizzando il software della fotocamera del microscopio. Per fare ciò, aprire l'immagine nel software della fotocamera del microscopio e fare clic su Annotazioni e misurazioni. Nella sezione Lunghezza, seleziona lo strumento linea semplice.

Fare clic sull'immagine, quindi tracciare una linea lungo la lunghezza del tubo, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse per eseguire il calcolo. Successivamente, ripeti la procedura per tutte le linee del tubo nell'immagine selezionando lo strumento linea semplice. Fare clic sull'immagine, tracciare una linea lungo la lunghezza del tubo, quindi fare clic con il pulsante destro del mouse.

Il software registrerà la lunghezza di ogni riga e visualizzerà i dati sullo schermo. Dopo aver misurato ogni tubo nell'immagine, fai clic su Esporta, quindi scegli "Lunghezza in foglio di calcolo" per esportare i dati di lunghezza in un foglio di calcolo. Aggiungi tutte le lunghezze dei tubi dal foglio di calcolo per ottenere la lunghezza totale del tubo.

Successivamente, calcola e registra la lunghezza media dei tubi. In questa procedura, la coltura e l'esecuzione di un saggio di formazione del tubo nella piastra a 12 pozzetti. Incubare le cellule per quattro-16 ore per formare le provette.

Successivamente, aspirare il terreno di coltura cellulare e sciacquare le cellule con un millilitro di 1XPBS freddo senza calcio e magnesio. Successivamente, aggiungere un millilitro di tampone PBS ghiacciato con EDTA da 2,5 millimolari sulla coltura e tenerlo in ghiaccio per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere le cellule e la miscela di matrice extracellulare dal piatto utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 microlitri con il puntale tagliato.

Quindi, trasferire le cellule in una provetta fredda da 15 millilitri. Lavate bene la fontana con quattro millilitri di PBS ghiacciato e mettetela nello stesso tubo. Quindi, metti il tubo sul ghiaccio per una o quattro ore e capovolgi il tubo alcune volte fino a quando la matrice extracellulare non si è sciolta.

Dopodiché, centrifugalo per 10 minuti a zero gradi Celsius. Quindi, risospendere il pallet di celle con un millilitro di PBS freddo in un tubo da 1,5 millilitri su ghiaccio. Centrifugare nuovamente per cinque minuti a zero gradi Celsius.

Quindi, smaltire il surnatante e conservare le cellule a 80 gradi Celsius. Queste due immagini mostrano la formazione di tubi endoteliali sulla matrice extracellulare normale e sulla matrice extracellulare GFR. La rete interconnessa di tubi mostra chiaramente che la crescita dei tubi è sana in questi HUVEC.

Queste due immagini mostrano l'inibizione della formazione di tubi da parte di un inibitore di CXCR2, SB225002, a 5,6 micromolari sulla matrice extracellulare normale e sulla matrice extracellulare GFR. I grumi isolati di HUVEC visti in questa immagine mostrano che le cellule non sono state in grado di formare i tubi necessari per connettersi tra loro. Questo grafico mostra che la risposta HUVEC all'inibitore CXCR2 sulla matrice extracellulare GFR è dose-dipendente.

Dopo la procedura, è possibile eseguire altri metodi come il QRTPCR o il sequenziamento dell'RNA utilizzando le cellule preparate. Dati come la lunghezza media del tubo, il numero totale di tubi o il numero totale di punti di ramificazione possono essere ottenuti utilizzando immagini per caratterizzare il processo di angiogenesi in condizioni sperimentali.