Name: 人体血液中测粒及单核细胞吞噬功能和呼吸爆发活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学习使用流式细胞术测量人体全血中粒细胞和单核细胞的吞噬功能及呼吸爆发活性。该方法操作简便，可根据实验室资源灵活调整，适用于免疫学和运动生理学研究。

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作者谨此感谢 Zack Shue、Casey John 和 Lynn Cialdella-Kam 在本实验方案优化过程中提供的协助。

<ol><li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+pistachios+on+performance+and+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+immune+dysfunction%2C+and+metabolite+shifts+in+cyclists%3A+a+randomized%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial.</a> PLoS One. 9, e113725(2014).</li>
<li>Knab, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+freeze-dried+juice+blend+powder+on+exercise-induced+inflammation%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+function+in+cyclists%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Physiol+Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists.</a> Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).</li>
<li>Konrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+effect+of+ingesting+a+quercetin-based+supplement+on+exercise-induced+inflammation+and+immune+changes+in+runners%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Sport+Nutr+Exerc+Metab%22%5BJournal%5D)">The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners.</a> Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+inflammation+responses+to+a+3-day+period+of+intensified+running+versus+cycling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling.</a> Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+supplementation+affects+blood+granulocyte+and+monocyte+trafficking+but+not+function+after+2.5+h+of+running%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running.</a> Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).</li>
<li>Tidball, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cell+response+to+acute+muscle+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Sports+Exerc%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cell response to acute muscle injury.</a> Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+burst+of+circulating+neutrophils+following+traumatic+brain+injury+in+human%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human.</a> PLoS One. 8, e68963(2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+flow+cytometry+technique+to+evaluate+changes+in+granulocyte+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+response+to+obesity+and+moderate+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obes+Relat+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Immune response to obesity and moderate weight loss.</a> Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).</li>
<li>Nieman, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+in+female+elite+rowers+and+non-athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Immune function in female elite rowers and non-athletes.</a> Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+model+for+the+multi-parametric+quantification+of+the+cellular+interactions+between+Candida+yeasts+and+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes.</a> PLoS One. 7, e32621(2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本论文提供了一种测定粒细胞和单核细胞功能两项指标的逐步操作方案。我们已确定该实验成功所必需的若干关键步骤。其中一个关键步骤是在添加细菌前立即进行冰浴孵育。充分冷却所有样品可最大限度地减少温度对吞噬作用和氧化爆发（OB）活性的影响。另一个关键步骤是向每个样品中加入细菌。采用8:1的细菌：吞噬细胞比例可获得最佳结果；但其他研究人员可能会发现需要调整此比例以获得理想结果。另一个关键步骤是使用红细胞裂解液和白细胞固定液来裂解红细胞并固定白细胞。使用此类试剂可确保红细胞完全裂解，并使研究人员能够将处理后的样品安全地在4 °C下过夜保存，然后于次日进行流式细胞术检测。此前的未发表研究结果表明，使用红细胞裂解和白细胞固定方法可将固定样品的流式细胞术检测延迟长达12小时，而不会影响数据的完整性。
该实验方案可根据研究者的能力和兴趣进行灵活调整，但需要强调的是，任何修改均需进行必要的优化。已有报道中一些最常见的调整包括目标细菌、标记物/探针以及孵育时间。研究者在调整这些参数时已获得了优异的结果。 大肠杆菌7,8 代替 S. aureus 作为...

粒细胞和单核细胞的吞噬作用/氧化爆发（OB）活性检测是一种简单直接的技术，常用于获取长时间高强度运动后先天免疫功能的相关信息。1-4 在研究免疫系统对刺激的反应时，粒细胞和单核细胞尤为值得关注，因为它们在宿主防御中起核心作用，并且是最早在感染部位聚集的免疫细胞。5 中性粒细胞作为粒细胞的一种，是在高强度运动后最先迁移至受损肌肉组织的细胞。6 吞噬作用和氧化爆发活性是评估粒细胞和单核细胞功能最常用的指标7，由于其在感染过程和修复过程中均发挥关键作用，因此被优先选作先天免疫细胞功能的指示参数。
本论文所述的方法利用基础流式细胞仪，对全血中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发（OB）活性进行定量测定。该技术采用全血具有优势，因为它无需耗时的细胞纯化步骤即可完成检测。本方法可轻松调整，以适应多种研究设计和实验室条件。例如，Liao et al. 采用类似技术发现，创伤性脑损伤后中性粒细胞的OB活性升高，而吞噬功能下降。8 另一个例子中，McFarlin et al. 报道了对该技术的一项精巧改进，即使用别藻蓝蛋白（APC）偶联的CD66b抗体以及高性能APC串联偶联的CD45抗体，并结合基于成像的流式细胞术，对粒细胞的吞噬活性和OB活性进行分类分析。7,9
近20年来，我们的研究团队已将该技术的多种改进方法用于评估超重、肥胖及运动员人群中先天免疫功能的指标。10,11 下文将为读者提供执行该检测的逐步操作说明，并指出读者可根据自身研究需求进行调整的环节。

<table><tbody><tr><td>12 x 75 mm 带盖试管</td><td>VWR</td><td>20170-579</td><td>每个样本需要 2 支试管（“H”和“F”），每批次额外需要 3 支试管（用于检测对照；“F”、“H”和“仅血液”）。</td></tr><tr><td>PBS（10 倍浓度），pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>瓶顶式 0.2 &amp;micro;m 醋酸纤维素滤器（500 ml 容量）</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-741-07&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖，粉末</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸（无水，经细胞培养测试，植物细胞培养测试）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404-100G</td><td></td></tr><tr><td>三水合柠檬酸钠二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-25G</td><td></td></tr><tr><td>二氢乙啶（氢乙啶）（HE）</td><td>Life Technologies</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>无水二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌&amp;nbsp;（不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，荧光素偶联物（FITC）</td><td>Life Technologies</td><td>S2851</td><td></td></tr><tr><td>金黄色葡萄球菌&amp;nbsp;（不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，未标记</td><td>Life Technologies</td><td>S-2859</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>4.0 ml 真空采血管，含 7.2 mg 喷雾干燥 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>VWR</td><td>BD367861</td><td>每个样本需要 1 支 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA 血液采集管。</td></tr><tr><td>4.0 ml 真空采血管，内壁喷雾涂覆含 68 USP 单位锂肝素</td><td>VWR</td><td>BD367884</td><td>每个样本需要 1 支锂肝素血液采集管。</td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff CP</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605705</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，血细胞分析仪</td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff Rinse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547167</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff Fix</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547171</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff WBC Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547170</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff Hgb Lyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547168</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff Cal 校准品</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547175</td><td></td></tr><tr><td>COULTER Ac&amp;middot;T 5diff Control Plus</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547198</td><td></td></tr><tr><td>AcT 5diff 稀释液</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547169</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 加长型移液器吸头</td><td>VWR</td><td>37001-526</td><td></td></tr><tr><td>隔热冰盘</td><td>VWR</td><td>89198-980</td><td>用于冰水浴。</td></tr><tr><td>开放式金属试管架</td><td>VWR</td><td>60916-702</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>26140-111</td><td></td></tr><tr><td>TQ-Prep 工作站</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605429</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，自动化细胞裂解制备工作站</td></tr><tr><td>ImmunoPrep 试剂系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546999</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，红细胞裂解/白细胞固定试剂系统</td></tr><tr><td>Cytomics FC500 MCL 流式细胞仪系统，配备 CXP 软件</td><td>Beckman Coulter</td><td>626553</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlow 包围液</td><td>Beckman Coulter</td><td>8547008</td><td></td></tr><tr><td>COULTER CLENZ</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Flow-Check 荧光微球&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605359</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，用于校准和流路验证的荧光微球</td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，流式细胞术分析软件</td></tr><tr><td>Excel 软件</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel</td><td>&lt;em&gt;即&lt;/em&gt;，电子表格程序</td></tr></tbody></table>

测量人血液中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发活性

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发（OB）活性检测可用于研究先天免疫系统。本文提供了将该检测方法纳入运动免疫学研究工具所需的方法学。该检测的第一步是制备两份全血（肝素抗凝）样品（分别标记为“H”和“F”）。然后向H份样品中加入二氢乙啶，将两份样品均在温水浴中孵育，随后转移至冷水浴。接下来，向H份样品中加入金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus），向F份样品中加入异硫氰酸荧光素标记的S. aureus（细菌：吞噬细胞 = 8:1），两份样品再次在温水浴中孵育后转移至冷水浴。随后，向每份样品中加入台盼蓝以淬灭胞外荧光，细胞用磷酸盐缓冲液洗涤。接着裂解红细胞，并固定白细胞。最后，使用流式细胞仪及相应的分析软件检测粒细胞和单核细胞的吞噬作用及OB活性。该检测方法已应用超过20年。在经历剧烈且长时间的运动后，运动员的吞噬作用会出现显著但短暂的升高，而OB活性则出现持续性下降。运动后吞噬作用的升高与炎症反应相关。与正常体重个体相比，超重和肥胖个体的粒细胞和单核细胞吞噬作用长期处于升高状态，且与C反应蛋白呈轻度相关。综上所述，这一基于流式细胞术的检测方法可评估吞噬细胞的吞噬作用和OB活性，可作为运动和肥胖诱导炎症的附加评估指标。

长时间且高强度的运动对先天免疫功能具有显著影响，包括自然杀伤细胞功能、巨噬细胞通过细胞因子介导的抗病毒感染反应，以及粒细胞和单核细胞的吞噬作用和氧化爆发（OB）活性。多项研究表明，运动后粒细胞和单核细胞的吞噬作用显著增强，反映出由肌肉损伤和代谢需求所引发的炎症反应。相反，运动后粒细胞和单核细胞的OB活性下降，这可能是感染易感性增加的一个免疫学指标。例如，图1显示，在完成75公里自行车骑行（70% VO2MAX）后，粒细胞对S. aureus的吞噬作用立即升高，并在1.5小时后仍保持升高，至次日早晨恢复至正常水平。单核细胞的吞噬作用也受到类似程度运动的相似影响。图2显示，粒细胞的OB活性在75公里骑行后至少持续降低21小时。单核细胞的OB活性在75公里骑行后同样下降。
粒细胞和单核细胞对S. aureus的吞噬作用与全身性炎症生物...

本论文的目的是介绍一种用于测定人血液样本中单核细胞和粒细胞吞噬作用及氧化爆发活性的方法。

粒细胞和单核细胞吞噬作用与氧化爆发（OB）活性检测可用于研究先天免疫系统。本论文提供了将该检测方法纳入运动免疫学研究工具所需的方法学。该检测的第一步是制备两份全血（肝素抗凝）样品，分别标记为“H”和“F”。然后向H样品中加入二氢乙啶，将两份样品均在温水浴中孵育，随后转移至冷水浴。接着，向H样品中加入金黄色葡萄球菌（S. aureus），向F样品中加入异硫氰酸荧光素标记的金黄色葡萄球菌（细菌：吞噬细胞 = 8:1），两份样品再次在温水浴中孵育后转移至冷水浴。随后，向每份样品中加入台盼蓝以淬灭胞外荧光，细胞用磷酸盐缓冲液洗涤。接着，裂解红细胞并固定白细胞。最后，使用流式细胞仪及相应的分析软件检测粒细胞和单核细胞的吞噬作用与OB活性。该检测方法已应用超过20年。在经历剧烈且长时间的运动后，运动员的吞噬作用会出现显著但短暂的升高，而OB活性则出现持续性下降。运动后的吞噬作用升高与炎症反应相关。与正常体重个体相比，超重和肥胖个体的粒细胞和单核细胞吞噬作用长期处于升高状态，并与C反应蛋白呈轻度相关。综上所述，该基于流式细胞术的检测方法可评估吞噬细胞的吞噬作用与OB活性，可作为评估运动和肥胖诱导炎症的补充指标。

本实验的总体目标是测量全血中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发活性。该方法有助于回答免疫学领域的一些关键问题，例如特定饮食干预如何影响机体对运动的免疫应答。该技术的主要优势在于其操作简便、流程直接，且可根据现有的实验室资源和研究兴趣进行灵活调整。在过去的二十年中，我们在多项运动试验中一直采用这种先天免疫功能的检测方法，稍后将在视频中分享其中一些数据。在开始实验操作前，按照制造商的说明，使用血液学分析仪对血液样本进行全血细胞计数，并完成白细胞分类分析。记录各样本的白细胞计数（单位：个/毫升），以及中性粒细胞和单核细胞的百分比数值。然后，针对每个实验管和对照管，使用加长型移液吸头将100 µL全血样本从含锂肝素的采血管转移至相应标记的12 × 75 mm试管底部。完成全部血液转移后，向用红色墨水标记并标有 H 的试管（包括 HE 对照管）中加入10 µL HE 工作液。打开试管盖。将样品短暂涡旋混匀，然后将离心管转移至37°C水浴中的开放式金属架中，每5分钟轻轻振荡一次。15分钟后，迅速将金属架及离心管转移至冰水浴中，继续孵育12分钟，期间每5分钟轻轻振荡一次。孵育结束后，向标有红色墨水和字母H的离心管（包括HE对照管）中加入适当体积的未标记金黄色葡萄球菌工作液。将管子盖上管盖后短暂涡旋震荡。然后向用黑色墨水标记并带有 F 的管子（包括 FITC 对照管）中加入适量体积的 FITC 标记的金黄色葡萄球菌工作液，并短暂涡旋震荡样品。接着，将所有管子置于 37°C 水浴中孵育 20 分钟，每隔 5 分钟摇动一次，随后在冰水中冷却 1 分钟。将样品置于室温后，使用多通道移液器向所有试管中加入 100 微升冰上预冷的淬灭溶液，并涡旋混匀样品。将样品重新放回冰浴中。一分钟后，使用多通道移液器向每支试管中加入 1 毫米冰上预冷的 PBS。然后涡旋混匀各管，并向样品中再加入 2 毫升 PBS。离心细胞并吸除上清液。使用多通道移液器，向各管中加入 50 微升冰上预冷的 FBS。涡旋混匀后，将所有离心管转移至转盘中。使用自动化细胞裂解制备工作站，按照制造商说明书裂解红细胞并固定白细胞。为通过流式细胞术分析检测结果，打开流式细胞仪系统采集软件，并创建一个新的实验方案。在吞噬作用检测中，为FL1参数选择FITC，在氧化爆发活性检测中，为FL2参数选择HE。创建前向散射与侧向散射的点图、FL1直方图和FL2直方图。然后在前向散射与侧向散射图上为白细胞、粒细胞和单核细胞群体创建多边形区域，并在直方图上创建线性区域。先运行仅血液的阴性对照样本，随后运行HE和FITC阳性对照样本，查看直方图，并根据需要调整FITC和PE通道的光电倍增管电压。然后开始对照样本的数据采集。经过15分钟平衡期后，按照工作列表上的顺序将实验样本加载到样品盘中，并开始研究样本的分析。为评估样本的吞噬活性，首先将所有

measuring-granulocyte-monocyte-phagocytosis-oxidative-burst-activity

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科研

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