ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

このアッセイの全体的な目標は、全血中の顆粒球および単球の食作用と酸化的バースト活性を測定することです。この方法は、特定の食事介入が運動に対する免疫反応にどのように影響するかなど、免疫学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、シンプルでわかりやすいアッセイであり、利用可能なラボリソースや研究の関心を考慮して簡単に変更できることです。

私たちは過去20年間、多くの運動試験でこの自然免疫機能の測定値を使用してきましたが、これらのデータの一部はビデオの後半で共有します。手順を開始する前に、血液分析装置を使用して、製造元の指示に従って血液サンプルの白血球差分析で全血球計算を実行します。ミリリットルあたりの細胞数で表した白血球数と、サンプルの好中球と単球の割合の値をメモします。

次に、各実験チューブおよびコントロールチューブについて、延長された長さのピペットチップを使用して、各全血サンプルの100マイクロリットルをリチウムヘパリン採血管から適切にラベル付けされた12×75ミリメートルのチューブの底に移します。すべての血液が移されたら、HEコントロールチューブを含む、赤インクとHでラベル付けされたチューブに10マイクロリットルのHEワーキング溶液を追加します。チューブのキャップを外します。

サンプルを短時間ボルテックスし、チューブをオープンメタルラック内の摂氏37度のウォーターバスに移し、5分ごとに穏やかに振とうします。15分後、ラックとチューブを氷水浴にすばやく移し、5分ごとに穏やかに振とうしながら12分間浴します。インキュベーションの終了時に、赤インクとHで標識されたチューブ(HEコントロールチューブを含む)に、適切な量の非標識黄色ブドウ球菌ワーキング溶液を加えます。

キャップでチューブを短時間ボルテックスします。次に、黒インクとFで標識されたチューブ(FITCコントロールチューブを含む)に、FITC標識黄色ブドウ球菌ワーキング溶液を適量加え、サンプルを短時間ボルテックスします。次に、すべてのチューブを摂氏37度のウォーターバスで20分間インキュベートし、5分ごとに振とうした後、氷水で1分間クールダウンします。

サンプルを室温に置いた後、リピーターピペットを使用して100マイクロリットルの氷冷クエンチ溶液をすべてのチューブに加え、サンプルをボルテックスします。サンプルを氷浴に戻します。1分後、リピーターピペットを使用して、各チューブに1mmの氷冷PBSを追加します。

次に、チューブをボルテックスし、さらに2ミリリットルのPBSをサンプルに加えます。次に、細胞を遠心分離し、上清を吸引します。リピーターピペットを使用して、50マイクロリットルの氷冷したFBSをチューブに追加します。

ボルテックス後、すべてのチューブをカルーセルに移します。自動細胞溶解調製ワークステーションを使用して、赤血球を溶解し、製造元の指示に従って白血球を固定します。アッセイ結果をフローサイトメトリーで解析するには、フローサイトメトリーシステム取得ソフトウェアを開き、新しいプロトコールを作成します。

食作用アッセイのFL1パラメータにはFITCを、酸化バースト活性アッセイのFL2パラメータにはHEを選択します。前方散布図と側面散布図のドット プロット、FL1 ヒストグラム、FL2 ヒストグラムを作成します。次に、前方散布図と片側散布図で白血球、顆粒球、単球集団の多角形領域を作成し、ヒストグラムで線形領域を作成します。

次に、血液のみのネガティブコントロールサンプルを実行し、続いてHEおよびFITCポジティブコントロールサンプルを実行し、ヒストグラムを確認し、必要に応じてFITCおよびPEチャネルの光電子増倍管電圧を調整します。次に、コントロールサンプルのデータ収集を開始します。15分間の平衡化期間の後、ワークリストの順序に従って実験サンプルをカルーセルにロードし、研究サンプル分析を行います。

サンプルの食作用活性を評価するには、まずすべてのF標識サンプルとコントロールリストモードのデータファイルを1つのフォルダに統合し、ファイルをフローサイトメトリー解析ソフトウェアのサンプルスペースにドラッグします。コントロールサンプルをダブルクリックし、ポリゴンゲートセレクターを使用して、チャートの端にあるすべての細胞を含めるように注意しながら、白血球総集団のゲートを設定します。このゲートにWBCのラベルを付けます。

WBCゲートをダブルクリックし、楕円形ゲートセレクターを使用してリンパ球ゲートを設定します。ゲートにラベルを付け、ゲート データの割合を横にドラッグして、セルが見やすくなるようにします。次に、ポリゴンゲートセレクターを使用して、顆粒球ゲートと単球ゲートを設定します。

各ゲートに適切なラベルを付け、ゲート データの割合を横にドラッグします。FITCコントロールサンプルをダブルクリックし、続いて顆粒球ゲートをダブルクリックし、ドロップダウンメニューを使用してX軸をFL1に、Y軸をサイドスキャッター(SS)に設定します。正方形のゲートセレクターを使用して、食作用陰性ゲートと食作用陽性ゲートを設定します。顆粒球集団の食作用陽性ゲートを強調します。

次に、「ワークスペース」と「統計の追加」をクリックします。幾何平均とFL1をハイライト表示して、食作用陽性顆粒球の蛍光強度を生成し、[追加]をクリックします。次に、親統計量の度数を選択し、「追加」をクリックして、食作用陽性の顆粒球の割合を生成します。

これらの設定をすべてのスタディ サンプルに適用するには、FITC制御サンプルで作成されたすべてのゲートと統計をハイライト表示し、グループパネルの[すべてのサンプル]領域にドラッグします。作業内容を WSP ファイルとして、リスト モードのデータ フォルダと同じフォルダに保存します。次に、データセットの最初の実験サンプルをクリックし、白血球ゲートが各サンプルの細胞分布に適切に適合していることを確認し、必要に応じてゲートの端を調整します。

次に、最初の実験サンプルの白血球ゲートをクリックし、顆粒球、単球、およびリンパ球のゲートが各サンプルの細胞分布に適合することを確認し、必要に応じてゲートを調整します。ファイルを保存した後、テーブルエディタのアイコンをクリックし、関心のある各統計をテーブルにドラッグします。「テーブルを作成」をクリックして、データをスプレッドシート形式で表示し、作業内容を XLSX ファイルとして保存します。

次に、H標識酸化バースト活性サンプルとコントロールリストモードデータファイルについて、先ほど示したように分析を繰り返します。この代表的な実験で実証されたように、黄色ブドウ球菌の顆粒球媒介性食作用は、75kmのサイクリングの試合の直後と1.5時間後に増加し、翌朝には正常に戻ります。顆粒球の酸化的バースト活性は、このレベルの活性の後、少なくとも21時間減少します。

さらに、顆粒球食作用と血清C反応性タンパク質レベルとの間には適度な相関関係があり、106人の過体重または肥満の女性のこの分析で観察され、安静時の被験者における高い顆粒球および単球食作用が全身性炎症を示している可能性があることを示しています。この手法を習得すると、適切に実行すれば、7時間で約30サンプルを完了することができます。この手順を試行する際は、細菌を添加する前にサンプルを完全に冷却して、サンプル間の説明できないばらつきを最小限に抑えることが重要です。

この手順に続いて、サイトカイン定量などの他の方法を実行して、炎症反応に対する介入の効果を判断できます。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が、ヒトのさまざまなライフスタイルの変化と自然免疫機能の影響を調査する道を開きました。このビデオを見れば、フローサイトメーターで顆粒球と単球の食作用、および酸化バースト活性を測定する方法について十分に理解できるはずです。

人間の血液を扱う作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切なPPEを着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。