الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير طرق هندسة وراثية فعالة لأنواع الخميرة غير التقليدية ، بما في ذلك بناء تحويل الحمض النووي ، وتحويل الحمض النووي ، واختيار المحول ، وحذف الجينات المستهدف عن طريق إعادة التركيب المتماثل. لقد أنشأنا تقنية حذف الجينات عالية الرؤية في سلالة اليارويا ليبوليتيكا PO1G مع تطبيقات محتملة في إنتاج الوقود الحيوي والكيماويات الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل تعطيل الجينات بوساطة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي توفر كميات كبيرة من هلال حذف الجينات ومجموعة واسعة من العلامات القابلة للتحديد.

في هذه الدراسة ، أبلغنا عن بروتوكول التحول الجيني لسلالة اليارويا lipolytica PO1G الفعالة والسهلة وذات السمعة الطيبة والقابلة للتكاثر. تظهر سلالة حذف اليارويا lipolytica PO1G KU70 التي تم إنشاؤها في هذه الدراسة تردد إعادة تركيب متماثل فعال للغاية يتيح فحوصات أسرع وأسهل لحذف الجينات المستهدفة. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تضخيم كاسيت تعبير LEU2 من متجه تعبير Y.lipolytica وإدخال مواقع LoxP في النهايات المكونة من 5 و3 أوليات لشريط LEU2.

يتم أيضا إدخال موقع تقييد BamHI في التمهيدي الأول للخطوات اللاحقة لعملية الاستنساخ. بعد تنقية كاسيت LoxP المروج LEU2 LoxP ، تتم إضافة ثلاثة أجزاء متدلية من prime-A إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى. ثم يتم ربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو الذيل A في ناقل استنساخ TA لإنتاج البلازما T-LEU2.

تتمثل الخطوة الثانية في تفاعل البوليميراز المتسلسل في تضخيم تسلسل المنبع الواحد كيلو بيس 5 أولي لجين KU70 باستخدام بادئات ثلاثة وأربعة من الحمض النووي الجيني Y.lipolytica PO1G. بعد ذلك ، يقوم الهضم المزدوج بكل من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى وبلازميد T-LEU2 مع إنزيمات SacII و BamHI وربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى والمهضوم بمواقع SacII BamHI من T-LEU2 لإنتاج البلازميد T-LEU2-5E. تتمثل الخطوة الثالثة في تفاعل البوليميراز المتسلسل في تضخيم تسلسل المصب الواحد كيلو بيس 3 أولي لجين KU70 باستخدام البادئات الخامسة والسادسة من الحمض النووي الجيني Y.lipolytica PO1G.

ثم قم بهضم كل من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى وبلازميد T-LEU2-53 مع إنزيمات NotI و NdeI وربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى والمهضوم بمواقع NotI NdeI من T-LEU2-5E لإنتاج بلازميد T-KO. أخيرا ، قم بهضم بلازميد T-KO مع إنزيمات SacII و NdeI لإنتاج كاسيت الاضطراب. ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا Y.lipolytica PO1G المختصة.

تلقيح مستعمرة من سلالة Y.lipolytica PO1G من مستخلص الخميرة الطازجة من سكر العنب أو صفيحة YPD في 10 مل من وسط YPD في قارورة سعة 100 مل. احتضن في حاضنة اهتزاز 30 درجة مئوية عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 20 ساعة حتى التشبع. في اليوم التالي ، قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد لمدة خمس دقائق عند 5000 مرة G في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الخلايا ب 20 مل من المخزن المؤقت TE وحبيبات الخلايا مرة أخرى. بعد إزالة المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في مليلتر واحد من أسيتات الليثيوم 0.1 مولار واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قسم الخلايا المختصة إلى 100 ميكرولتر في أنابيب معقمة سعة 1.5 مل.

انتقل على الفور إلى إجراء التحويل عن طريق خلط 10 ميكرولتر من الحمض النووي للحيوانات المنوية من السلمون المشوه برفق وواحد إلى خمسة ميكروغرام من كاسيت الاضطراب المنقى مع 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة. احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف 700 ميكرولتر من 40٪ بولي إيثيلين جلايكول ل 1000.

تخلط جيدا وتحتضن في حاضنة اهتزاز 30 درجة مئوية عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتسخين خليط التحويل عن طريق وضع الأنبوب في حمام مائي 39 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد 60 دقيقة ، أضف ملليلترا واحدا من وسط YPD إلى الأنبوب واسمح للخلايا بالتعافي لمدة ساعتين عند 30 درجة مئوية عند 225 دورة في الدقيقة.

جهاز طرد مركزي عند 9000 مرة جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت TE. الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى والتخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE واللوحة على الصفيحة التي تعاني من نقص الليوسين. احتضان اللوحة عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. قبل إجراء إنقاذ علامة إعادة تركيب CRE بوساطة ، يتم إنشاء بلازميد تعبير CRE كما هو موضح في بروتوكول النص.

تتضمن بعض ميزات هذا البلازميد المكرر عرضيا جين إعادة تركيب CRE ، وعلامة مقاومة Hygromycin B ، وجين مقاوم للأمبيسيلين. لبدء هذا الإجراء ، قم بتحويل بلازميد تعبير CRE إلى خلايا مختصة من سلالة الضربة القاضية KU70 باتباع بروتوكول التحويل الموضح سابقا. قم بوضع الخلايا المحولة على ألواح YPD بالإضافة إلى hygromycin B واحتضانها عند 30 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد إجراء مستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو موضح في بروتوكول النص لتحديد المستعمرات الإيجابية ، اختر استنساخا موجبا لتلقيح ملليلترين من وسط YPDH واحتضانه في حاضنة اهتزاز 30 درجة مئوية عند 225 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها حتى التشبع. في اليوم التالي ، قم بقياس OD 600 للثقافة باستخدام مقياس الطيف الضوئي. عندما تكون الخلايا في OD 600 من حوالي 15 ، قم بالحصاد عن طريق الطرد المركزي عند 5000 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة المادة الطافية ، أضف ملليلترين من الماء المعقم وقم بتدويرها مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في وسط YPD أعد تلقيح الخلايا إلى ملليلترين من وسط YPD مع OD 600 الأولي 0.1. واسمح للخلايا بالنمو في حاضنة 30 درجة مئوية عند 225 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، قم بربط ثقافة الخلايا الليلية على ألواح YPD لعزل مستعمرات فردية. احتضن عند 30 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات. مستعمرات الألواح المقلدة على لوحات YPD و YPDH و Leucine.

احتضان الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة يومين. يظهر مخطط لبلازميد الضربة القاضية KU70. ينتج هضم من البلازميد مع [سكي] و [ندي] إنزيمات الاضطراب كاسيت.

يؤكد الرحلان الكهربائي للهلام وجود نطاق 4.3 كيلو قاعدة ، وهو الحجم المتوقع لشريط الاضطراب. تم تأكيد حذف جين KU70 في Y.lipolytica PO1G بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تحتوي الممرات من 1 إلى 10 على منتجات PCR مضبوطة من الحمض النووي الجيني للمحولات ويحتوي الممر 11 على منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من سلالة النوع البري.

الممر السابع ضربة قاضية إيجابية بينما يظهر الممر الأول إيجابيا خاطئا. تمت إزالة جين علامة الاختيار في سلالة الضربة القاضية KU70 في النهاية عن طريق التعبير عن إعادة تركيب CRE. تم التحقق من المحولات الإيجابية الخالية من العلامات من خلال نموها على لوحة YPD فقط.

للتحقق من زيادة معدل حذف الجينات ، بعد حذف جين KU70 ، تم حذف 11 جينا مستهدفا بشكل فردي باستخدام نفس الإجراء في سلالة الضربة القاضية KU70. تم تأكيد كل اضطراب جيني بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل وتظهر نتيجة تمثيلية هنا مع تحديد الممرات الأولى والثانية والرابعة على أنها ضربة قاضية إيجابية. توفر سلالة البلاتين لحذف اليارويا lipolytica PO1G KU70 نظاما أكثر كفاءة وخيارا أفضل للتطبيقات في هندسة المسار وتحسين الإجهاد عند إنشاء طفرات حذف الكروموسومات الأخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم شامل لاستراتيجية حذف الجين الفردي المستهدفة من خلال إعادة التركيب المتماثل في خلايا اليارويا lipolytica PO1G.