Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirksamkeit und Toxizität neuer RNAs, die auf die HIV-1-Produktion abzielen, zu vergleichen. Diese Methode kann helfen, neue RNA-Moleküle für die Verwendung von HIV-1-Gen- oder Medikamententherapien zu identifizieren, wie z. B. kurze Haarnadeln oder kleine interferierende RNAs, Ribozyme und RNA-Köder. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass mehrere neue RNA-Designs gleichzeitig mit einer kurzen Durchlaufzeit gescreent werden können.

Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um neue RNA-Medikamente oder Gentherapien für HIV zu evaluieren, kann sie auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z. B. kleine Moleküle oder CRISPR-Aufgaben. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir Experimente durchführten, um eine große Anzahl von Ribozymen auf Anti-HIV-Effekte zu untersuchen. Zu Beginn wird eine Suspension von humanen embryonalen Nieren-293T-Zellen in zwei mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter in DMEM mit 10 % FPS und 1 % Penicillin-Streptomycin hergestellt.

Geben Sie 500, 100 und 1.000 Mikroliter der Zellsuspension in jede der Vertiefungen von 24-, 96- und 12-Well-Platten für die Virusproduktion, die Zellviabilität bzw. Immunaktivierungsassays. Schwenken Sie die Platten vorsichtig und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid bis 50 % bis 70 % Konfluenz. Bereiten Sie für den Virusproduktionsassay eine Verdünnung von 10 Nanogramm pro Mikroliter eines HIV-1-Expressionsplasmids vor und geben Sie 10 Mikroliter in jedes Assay-Röhrchen.

Bereiten Sie als Nächstes fünf mikromolare Verdünnungen von Test-RNAs und einer negativen Kontroll-RNA vor. Geben Sie dann 2,5 Mikroliter oder 10 Mikroliter jeder Test-RNA und eine Negativkontrollverdünnung in die entsprechenden Röhrchen für 25 nanomolare oder 100 nanomolare Endkonzentrationen. Für den Zellviabilitätsassay sind fünf mikromolare Verdünnungen der Test-RNA und eine Verdünnung der Positivkontroll-RNA um 10 Milligramm pro Milliliter (Poly(I:C) mit niedrigem Molekulargewicht vorzubereiten. Zwei Mikroliter der Test-RNA oder der Positivkontroll-RNA-Verdünnungen werden in die entsprechenden Röhrchen gegeben, um Endkonzentrationen von 100 Nanomolaren oder 200 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. beziehungsweise.

Für den Immunaktivierungsassay werden 20 Mikroliter Test-RNA oder Positivkontroll-RNA-Verdünnungen, wie sie für den Zellviabilitätsassay vorbereitet wurden, in die entsprechenden Röhrchen für 100 Nanomolare bzw. 200 Mikrogramm pro Milliliter Endkonzentrationen gegeben. Geben Sie dann 50, 25 oder 75 Mikroliter DMEM in jedes Transfektionsröhrchen für die Virusproduktion, die Zellviabilität bzw. die Immunaktivierung. Für Assays zur Virusproduktion bringen Sie Zellen und vorbereitete Transfektionsröhrchen vor dem nächsten Schritt in ein Labor der Biosicherheitsstufe drei (BSL-3).

Geben Sie nacheinander zwei Mikroliter des Transfektionsreagenzes in die Transfektionsröhrchen und inkubieren Sie es 15 bis 20 Minuten, damit sich Komplexe bilden können. Geben Sie die gesamte Transfektionsmischung aus jedem Mikroröhrchen tropfenweise an die entsprechenden Positionen in den Zellkulturplatten. Schwenken Sie die Platten vorsichtig und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Um den Virusproduktionsassay durchzuführen, werden die 24-Well-Zellkulturplatten nach der Entnahme aus dem Inkubator in die BSL-3-Zellkulturhaube überführt. Schwenken Sie die Platten vorsichtig und übertragen Sie dann 150 Mikroliter des Überstands aus jeder Vertiefung in eine entsprechende Vertiefung in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden, um die HIV-1-Produktion zu quantifizieren. Übertragen Sie fünf Mikroliter Überstand in die entsprechenden Vertiefungen in einer 96-Well-Platte, die 25 Mikroliter eines viralen Disruptionscocktails enthält.

Nachdem die Mischung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurde, wird die Platte an einen Radioaktivitätsarbeitsplatz gebracht. Bereiten Sie als Nächstes einen radioaktiven Cocktail zu und geben Sie 25 Mikroliter in jede Vertiefung des Virusüberstands und des Störungscocktails. Inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Fünf Mikroliter des Reaktionsgemisches auf entsprechende Quadrate in einem Glasfaser-/DEAE-Filtermattenpapier auftupfen und 10 Minuten trocknen lassen. Verwenden Sie 2x SSC-Puffer, um das Papier fünfmal für jeweils fünf Minuten zu waschen, gefolgt von zwei einminütigen Wäschen mit 95 % Ethanol. Lassen Sie die Papiere trocknen, bevor Sie sie in Probenbeutel verschließen.

Stecken Sie die Probenbeutel mit dem Filtermattenpapier in eine Kassette und setzen Sie die Kassette in einen Mikrotiterplatten-Szintillationszähler ein. Starten Sie dann den Zähler. Teilen Sie bei jeder viralen Quantifizierungsmethode die für jede Test-RNA erhaltenen Werte durch die benachbarte Negativkontrolle und multiplizieren Sie diesen Wert mit 100, um die prozentuale Hemmung der HIV-1-Produktion für jedes Replikat der Test-RNAs zu erhalten.

Um einen Zellviabilitätsassay durchzuführen, geben Sie nach der Entnahme der 96-Well-Platten aus dem Inkubator 20 Mikroliter mit fünf Milligramm MTT und DPBS pro Milliliter in jede Vertiefung. Dann inkubieren Sie die Platten drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 150 Mikroliter angesäuertes Isopropanol mit Reinigungsmittel in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie dann ein Mikroplatten-Spektralphotometer, um die Absorption bei 570 Nanometern zu bestimmen. Berechnen Sie den relativen MTT-Metabolismus für jede Positivkontrolle und testen Sie die RNA, indem Sie den für jede Probe erhaltenen Wert durch die benachbarte Transfektionskontrolle dividieren. Für den Immunaktivierungsassay wird nach der Entnahme der 12-Well-Platten aus dem Inkubator das Kulturmedium aspiriert und die Zellen mit DPBS zweimal vorsichtig gewaschen.

Geben Sie dann 70 Mikroliter Kaltlysepuffer mit Protease- und Phosphotase-Inhibitoren in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten 10 Minuten lang auf Eis. Übertragen Sie die Zelllysate auf Mikroröhrchen und frieren Sie sie schnell ein, indem Sie die Röhrchen in flüssigen Stickstoff tauchen. Nachdem Sie die Proben aufgetaut haben, frieren und tauen Sie sie zwei weitere Male ein, für insgesamt drei Gefrier-Tau-Zyklen.

Zentrifugieren Sie anschließend die Lysate bei 15, 700 g und 4 Grad Celsius für 15 Minuten, um die Zelltrümmer zu pelletieren. Dann, nach der Elektrophorese und dem Transfer auf eine Membran, legen Sie die Proteinbanden frei, indem Sie die Membran eine Minute lang in Ponceau S inkubieren. Waschen Sie es dann mit doppelt destilliertem Wasser.

Verwenden Sie die Bänder und die Proteinleiter als Führung, um die Membran bei 80 und 55 Kilodalton zu schneiden. Verwenden Sie nun TBS mit 0,05 %TWEEN 20 oder TBST, um die Ponceau S-Färbung auszuwaschen. TBST mit 5% fettfreier Milch hinzufügen, um die Membranen vollständig zu bedecken, und sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren inkubieren.

Übertragen Sie die Membranen in TBST mit 3 %BSA und 1:1.000 verdünnten Antikörpern für ADAR, Phosphor-PKR und Phosphor-IRF3 für das obere, mittlere bzw. untere Stück der Membran. Inkubieren bei 4 Grad Celsius unter Rühren über Nacht. Am nächsten Morgen verwenden Sie TBST, um die Membranen fünfmal für jeweils fünf Minuten zu waschen, bevor Sie eine Stunde lang mit 5 % fettfreier Milch und 1:5.000 Peroxidase-markierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern auf TBST umstellen.

Nachdem Sie die Proteinbanden auf Filmen sichtbar gemacht haben, waschen Sie mit einer Stripping-Lösung das mittlere und untere Stück der Membran 10 Minuten lang, bevor Sie das mittlere Stück der Membran in PKR-Antikörpern und das untere Stück mit IRF3-Antikörpern inkubieren. Als Positivkontrolle wird die untere Membran mit Antikörpern gegen Aktin gemäß dem Textprotokoll untersucht. Ein allgemeines Schema der Assays wird hier mit einem beispielhaften Transfektionsplan für drei Test-RNAs und eine Kontroll-RNA gezeigt.

Für Assays zur Virusproduktion und Zellviabilität wird der Messwert für jedes Testkonstrukt auf eine Negativkontrolle normiert. Unter Verwendung des HIV-1-Produktionsassays in Zellen, die mit einem Plasmid transfiziert wurden, das den HIV-1-Stamm NL4-3 exprimiert, wurde der Prozentsatz der RT-Aktivität in Zellen, die mit einer der hier gezeigten siRNAs co-transfiziert wurden, im Vergleich zu Zellen, die mit einer langen Dicer-Substrat-Nonsense-siRNA transfiziert wurden, berechnet, um die optimale Länge von RNA-Interferenzmolekülen zu identifizieren, die auf eine konservierte Stelle in der HIV-1-RNA abzielen. Unter Verwendung der effektivsten identifizierten siRNAs wurde der prozentuale Metabolismus von MTT für transfizierte Zellen bestimmt.

Entlang doppelsträngiger RNA reduzierte Poly(I:C)die Lebensfähigkeit der Zellen nur bei der höchsten Dosis. Für siRNAs, die auf die 1498-Stelle in der HIV-1-RNA abzielen, wurde unabhängig von ihrer Länge keine signifikante Verringerung der Zellviabilität beobachtet. Wie hier mittels Western Blot gezeigt, wurde der gleiche Satz von RNAs im Immunaktivierungsassay ausgewertet.

Unter Bedingungen, unter denen Poly(I:C)die Expression von ADAR1-p150 aktivierte und die Phosphorilierung von PKR und IRF3 induzierte, konnte für keine der Test-RNAs ein signifikanter Effekt auf Inaktivierungsmarker beobachtet werden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in sieben Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, hochwertige Präparate sowohl der RNA als auch der DNA für die Transfektion zu verwenden.

Darüber hinaus sollen die richtigen Negativ- und Positivkontrollen einbezogen werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden, wie die HIV-Infektion von transduzierten Zellen, verwendet werden, um die langfristige Wirksamkeit und Toxizität potenzieller Anti-HIV-Kandidaten zu bewerten. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte uns diese Technik, eine zugängliche und konservierte Zielstelle in der HIV-RNA zu identifizieren und die Formate von Ribozymen, shRNAs und siRNAs, die auf sie abzielen, zu optimieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie neue RNA-Kandidaten, die auf die HIV-Produktion abzielen, mit dem Virusproduktionsassay schnell auf Wirksamkeit und mit den Immunaktivierungs- und Zellviabilitätsassays auf potenzielle Toxizität untersuchen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit HIV und radioaktiv markierten Nukleotiden äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. die Verwendung zertifizierter Biosicherheits- und Radioaktivitätslabore.