分离及小鼠淋巴细胞的激活

本实验的总体目标是使用各种体外和体内功能测定研究纯化的小鼠淋巴细胞的功能能力。这种方法可以帮助回答免疫学和分子生物学领域的关键问题。例如研究基因缺陷淋巴细胞中目标蛋白质的功能。

该技术的主要优点是能够以最小的作和环境压力快速纯化淋巴细胞。要纯化 B 细胞，将红细胞重悬至第 1 次、10 至第 8 个红细胞，溶于 300 微升平衡盐溶液或补充有 FBS 的 BSS 中。然后加入 50 μL 抗 CD43 磁性微珠。

要去除死细胞，在 4 摄氏度下加入 30 μL Annexin 5 磁珠 30 分钟。每隔 15 分钟轻弹一次细胞悬液，以确保细胞标记均匀。孵育结束时，将 B 标记的细胞加入 14 毫升补充有 FBS 的 BSS。

离心后，取出上清液，轻弹试管，将沉淀重新悬浮在 1 至 3 毫升补充有 FBS 的室温 BSS 中。在离心过程中，将分离柱加载到磁力架上，并将无菌 21 号针头连接到色谱柱尖端以降低流速。用 2 mL 室温 BSS 平衡色谱柱。

沉淀重悬于 1 至 3 mL室温下后，BSS 将收集管置于针头下方，然后将 B 标记的细胞加载到平衡柱上。将流出液收集在 15 mL 锥形管中。然后用 1 mL 补充有 FBS 的新鲜 BSS 冲洗色谱柱。

将洗涤液与收集的目标细胞混合，用含有 aluet 的目标细胞重新加载色谱柱，将流过的流出物收集在同一根 15 mm 试管中。并用补充有 FBS 的 1 毫升 BSS 洗涤柱 3 次，继续将洗涤液与目标细胞悬液合并。第三次洗涤后，从磁力架上取下色谱柱，并加入 5 毫升补充有 FBS 的 BSS。

使用柱塞将磁性标记的非靶细胞冲洗到新的 15 mL 试管中。然后，通过流式细胞术检查分离细胞的纯度。为了重复使用分离柱，冲洗磁珠标记的细胞后，从顶部用 5 ml PBS 洗涤柱 3 次，每次洗涤用 5 ml 蒸馏水洗涤 3 次，每次洗涤用 5 ml 蒸馏水洗涤 3 次。

接下来，用 5 mL 70% 乙醇以相同的方式清洗色谱柱，并在储存前使用空气水龙头彻底干燥色谱柱。为了在新的纯化实验中重复使用色谱柱，请用 5 mL 70% 乙醇从下往上重新洗涤色谱柱，然后用 2 次 5 mL PBS 洗涤液。然后在柱顶部加入 5 ml PBS 进行最后一次洗涤。

并用两毫升室温 BSS 平衡色谱柱。然后，可以在色谱柱上加载实验细胞群。要用 CFSE 标记 B 纯化的细胞，请在 15 毫升锥形管中用新鲜制备的标记溶液洗涤细胞两次。

将第二个沉淀以每毫升浓度 2 倍 10 至第七个细胞重悬于新鲜的 37 摄氏度标记溶液中。每次离心样品，去除上清液并轻弹试管。然后将细胞标记为一份细胞悬液与一份新鲜制备的 10 微摩尔 CFSE 溶液比例，在 37 摄氏度下避光 10 分钟。

每两分钟倒置一次试管，以确保染料均匀分布。应小心确保细胞沉淀完全悬浮在标记溶液中。细胞团块会影响 CFSE 标记的均匀性。

在孵育结束时，加入 RPMI 培养基以淬灭 CFSE，并在几体积的冰冷的完全 RPMI 培养基中洗涤细胞两次。如果细胞已成功标记，则沉淀将为黄色。接下来，在 PBS 中洗涤涂有适当刺激物的 96 孔平底板两次。

对于 CFSE 标记的 B 细胞，将第六个 B 细胞重悬至每毫升 10 个的三倍，并完全 RPMI 培养基，并将每孔 100 μL B 细胞接种到包被板上，一式三份，一式三份，持续 72 小时。通过这种去除方法，微珠分离的 OT1-CD8 T 细胞的纯度可以从 72.8% 提高到 94.2%。然后可以用 CFSE 标记细胞，就像刚刚证明的那样，并过继转移到受体动物中以分析其体内增殖。

此外，抗 CD45.1 抗体标记可用于进一步确认 CFSE 表达细胞作为受体小鼠淋巴器官中过继转移的供体 CD-45.1 阳性 OT1-CD8 T 细胞的身份。或者，可以在体外刺激纯化的 T 细胞，并且可以通过氚化胸苷掺入来评估它们的增殖。该方法还实现了脾 B 细胞纯度的显着增加。

为纯化的 B 细胞的下游功能分析提供类似的机会。一旦掌握，这项技术可以在两个小时内完成。通过执行此程序，请务必始终将 CI 悬浮液放在冰上，尤其是在纯化和 CFSE 标记期间。

纯化的淋巴细胞也可用于其他功能测定，例如对转基因淋巴细胞的末端信号转导能力进行免疫印迹。观看此视频后，您应该对如何纯化 B 细胞和 T 细胞以及如何将细胞用于各种体外和体内功能测定有更好的了解。