In - vivo - Studie der menschlichen Endothelial-pericyte Interaktion Mit dem Matrix - Gel - Plug - Assay in der Maus

Das übergeordnete Ziel dieses In-vivo-Matrixgel-Assays besteht darin, die Wechselwirkung von Endothelzellen mit Parasiten zu untersuchen. Dieser Matrigel-Assay soll Forschern helfen, die wichtigsten Schritte der Androgenese zu analysieren. Außerdem ermöglicht er die Identifizierung von Signalwegen, die für wesentliche Schritte bei der Blutgefäßbildung verantwortlich sind, sowie von Genen, deren Funktionsstörung zu vaskulären Erkrankungen und anderen Abweichungen der Androgenese führen kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie uns die Untersuchung der in-vivo-Bildung von Blutgefäßen ermöglicht, an der sowohl Endothelzellen als auch ihre Stützzellen, die Perizyten, beteiligt sind. Zunächst kultivieren Sie humane Endothelzellen und Parasitenzellen auf 100-Millimeter-Platten mit jeweils 10 Milliliter geeignetem Kulturmedium. Ersetzen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen.

Um die Matrixgel-Lösung vorzubereiten, die mit den Zellen gemischt wird, tauen Sie eine Matrixgel-Probenvorratslösung über Nacht bei vier Grad Celsius auf. Bereiten Sie anschließend Aliquots von jeweils 1,5 Milliliter für die Langzeitlagerung bei minus 20 Grad Celsius oder für die Lagerung bei vier Grad Celsius bis zu zwei Wochen vor. Jeder experimentelle Gel-Plug benötigt 200 Mikroliter Matrixgel.

Ein gefüllter Reagenzglas kann somit sechs Plugs mit einem Überschuss von 25 % versorgen. Bereiten Sie jeden benötigten Aliquot durch Zugabe von 15 Mikrolitern aufgetauten 100x Beta-FGF-Stammlösung vor. Verrühren Sie den Beta-FGF durch Pipettieren, und inkubieren Sie danach mindestens 30 Minuten auf Eis, bevor Sie die Zellen hinzufügen.

Zu diesem Zeitpunkt einige 1-ml-Insulinspritzen mit 28er Kanüle zum Injizieren kühlen. Um die Zellen aus den Kulturplatten zu gewinnen, das Medium entfernen und die Zellen einmal mit PBS waschen. Nach dem Entfernen des PBS ein Milliliter Trypsin-Lösung hinzufügen und die Platten für eine Minute in den Inkubator zurückstellen.

Dann pipettieren Sie zwei Milliliter Kulturmedium über die Platten, um die Zellen abzulösen, und sammeln das Medium in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Überprüfen Sie nun die Konzentration der Proben mithilfe eines Hämozytometers. Bereiten Sie anschließend Aliquots der Zellen in 15-Milliliter-Röhrchen vor.

Hier wird für die experimentelle Gruppe eine Kombination aus einer Million Endothelzellen und 200.000 Parasiten verwendet. Zentrifugieren Sie danach die Zellaliquote bei 400g für fünf Minuten. Geben Sie anschließend das berechnete Volumen an Matrixgel zum Zellpellet hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren, sodass kein Schaum entsteht, da Luftblasen nicht injiziert werden dürfen.

Halten Sie die Vorbereitungen nun auf Eis, bis die Mäuse bereit zur Injektion sind. Nachdem ein Maus mit Isofluran anästhesiert wurde und der anästhesierte Zustand mittels Zehenquetschung bestätigt wurde, befestigen Sie die Maus am Nicht-Rückatmungssystem, das Isofluran liefert, und legen Sie sie auf die Heizplatte, Bauchseite nach unten. Entfernen Sie nun jeweils etwa einen Quadratzentimeter Fell aus beiden seitlichen Hinterregionen.

Reinigen Sie anschließend die freiliegende Haut mit 70 % Alkohol. Danach füllen Sie einen Milliliter der hergestellten Zellsuspension in eine gekühlte Spritze, was für vier Plugs ausreicht. Zum Durchführen einer Injektion heben Sie die Rückenhaut an, um den subkutanen Raum zu lokalisieren.

Injizieren Sie dann langsam 200 Mikroliter gleichmäßig in den subkutanen Raum hinter dem Rippenkorb und ziehen Sie die Nadel langsam heraus, um ein Auslaufen zu verhindern. Nach der Injektion bildet sich an der Einstichstelle eine Schwellung. Reinigen Sie die Stelle mit Alkohol und markieren Sie die Schwellung mit einem dauerhaften Stift, damit sie später wieder gefunden werden kann.

Wiederholen Sie dann das Injektionsverfahren auf der anderen Seite der Maus. Achten Sie darauf, alle Zellen innerhalb von drei Minuten zu injizieren, da sie andernfalls an der Spritze haften bleiben. Der Injektionsschritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass sich der Matrixgel-Plug zwischen Haut- und Muskelschicht bildet, sodass der Plug eine gute Form behält und nicht diffus wird.

Bevor mit der Injektion des nächsten Mäuses fortgefahren wird, sollte die injizierte Maus eine Minute lang auf der Heizplatte verbleiben, damit die Matrix Zeit zum Gelieren hat. Nach der Tötung die Maus auf dem Operationsstadium präparieren. Nach dem Entfernen eventuell nachgewachsener Haare an der Injektionsstelle die Markierungsstriche suchen, die die Position des Pfropfens kennzeichnen.

Danach mit feinen chirurgischen Scheren einen Schnitt entlang der markierten Grenze des Gewebestückes vornehmen, senkrecht zur Haut und bis zum darunterliegenden Muskel. Vorsichtig entlang des peripheren Randes der markierten Begrenzung schneiden. Anschließend das Gewebestück entfernen, wobei es zwischen Haut- und Muskelschicht belassen wird.

Spülen Sie den Pfropfen sofort in einem kleinen Becher mit PBS ab, um das Blut zu entfernen. Anschließend geben Sie den gesamten Pfropfen in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern 4 % Paraformaldehyd. Lassen Sie die Probe 24 Stunden bei Raumtemperatur ohne jegliche Agitation fixieren.

Am nächsten Tag überführen Sie die Gewebestücke in 25 Milliliter 70 %igem Ethanol für 24 Stunden. Anschließend führen Sie die Paraffineinbettung durch. Schnitte von Gewebestücken, die nur Endothelzellen enthalten, zeigen, dass einige Gefäße nach 14 Tagen in vivo nicht mit dem Blut des Wirts durchströmt werden.

Im Gegensatz dazu weisen Plugs, die sowohl Endothelzellen als auch Parasiten enthalten, nach 14 Tagen in vivo viele durchblutete Gefäße auf. In diesen Plugs finden sich Zellen, die positiv auf die Färbung für glatte Muskel-Aktin (rot dargestellt) sind und unmittelbar benachbart zu CD31-positiven Endothelzellen (grün dargestellt) liegen. Daher könnten Parasiten eine wesentliche Rolle bei der Neubildung von Blutgefäßen spielen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie diese leistungsstarke In-vivo-Technik anwenden können, um die Blutgefäßbildung unter Verwendung mehrerer Zelltypen zu untersuchen. Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, verschiedene Themen der Gefäßbiologie in Mausmodellen zu erforschen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können auch andere Methoden wie die quantitative PCR und die Western-Immunoblotting-Analyse durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise Veränderungen in der Genexpression und der Proteomik.

Diese leistungsstarke Technik ermöglicht es dem Forscher, in vivo zu untersuchen, wie Endothelzellen und Parasiten während der Blutgefäßbildung interagieren, was ein entscheidender Schritt in der Androgenese ist. Diese leistungsstarke Technik ermöglicht es dem Forscher außerdem, andere zelluläre Wechselwirkungen zwischen Zellen zu untersuchen, die für das Verständnis vaskulärer Erkrankungen wie beispielsweise der pulmonalen Hypertonie und anderer von Bedeutung sind.