Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

El objetivo general de este sistema de modelo de retina ex vivo es detectar fármacos que mejoren la ruptura de la barrera neuronal sanguínea. Este método puede responder a varias preguntas clave en el campo de las enfermedades neurodegenerativas, como cuáles son los eventos tempranos y cómo podemos detectar medicamentos que puedan ayudar a tratar a esos pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que es de bajo costo, fácil de usar, rápida y adaptable.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la obtención de datos confiables y reproducibles depende de las habilidades técnicas para generar buenas muestras. Aquí se utilizan las primeras retinas porcinas, obtenidas de una fuente comercial. Después de la obtención de la fuente, los globos oculares deben mantenerse a cuatro grados, o en hielo, y procesarse lo antes posible.

Comience la disección en un parasol de cultivo de tejidos cortando alrededor de la lente para abrir la tapa del ojo. Luego, con un cepillo, retire suavemente el humor vítreo, sin tirar de la retina. Utilice un cepillo para separar suavemente la retina del borde cortado, para exponer el disco óptico.

Corta el nervio óptico con una navaja y libera la retina. Transfiera la retina a una placa de Petri y enjuague cuidadosamente la retina una vez con HBSS frío. Coloque la muestra en HBSS sobre hielo.

A continuación, utiliza una navaja de afeitar para cortar la retina por la mitad de forma simétrica. Cuando se requieren tratamientos, se trata una mitad de la retina, mientras que la otra mitad de la misma retina debe procesarse para establecer la línea de base y corregir las variaciones animales. Transfiera suavemente las muestras a una placa de seis pocillos que contenga tres mililitros de medio de estabilización por pocillo.

Equilibrar las retinas durante 30 minutos a 37 grados centígrados en una incubadora con una atmósfera que contenga un 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, aspire cuidadosamente el medio de estabilización y agregue tres mililitros de medio que contenga histamina y LXA4 a cada pocillo. Incuba las muestras durante una hora más.

Después de enjuagar con PBS estéril tibio, agregue tres mililitros de PFA al 4% a cada pocillo e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, aspire rápidamente el PFA y enjuague las muestras una vez con PBS. Agregue un 10% de sacarosa a los pocillos e incube durante dos a cuatro horas a cuatro grados centígrados.

A continuación, sustituya el 10% de sacarosa por un 30% de sacarosa e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Luego mezcle una parte de medio de congelación comercial con dos partes de sacarosa al 20%, para hacer que el medio de congelación funcione. Dejar a cuatro grados centígrados durante la noche o más hasta que desaparezcan las burbujas de aire.

Al día siguiente, reemplace la sacarosa al 30% con medio de congelación de trabajo y deje que se equilibre durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después del equilibrio, recorte cada retina en rectángulos de tres milímetros por cinco milímetros, luego congele las rodajas de retina colocándolas en medio de congelación, contenido en un cilindro de papel de aluminio. Asegúrese de que los cortes de retina estén verticales para proporcionar una sección transversal de la retina al seccionarlos y congélelos en nitrógeno líquido.

Sección cada bloque en un criostato en rodajas de 14 micras y monte las secciones en portaobjetos de vidrio. Guarde los portaobjetos a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Comience la inmunotinción lavando las secciones con tampón de fosfato de sacarosa al 5 %, o SPB.

A continuación, bloquee los sitios de unión no específicos, incubando las secciones y bloqueando el tampón durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, incube las secciones con el anticuerpo primario adecuado durante una hora. Una vez transcurrida la hora, aspirar la solución y lavar las secciones tres veces en 5%SPB.

A continuación, incubar las secciones con los anticuerpos secundarios correspondientes durante una hora, mientras se protegen de la luz. Después de lavar las secciones tres veces con 5%SPB, prepare las muestras para la microscopía montándolas en un medio que contenga DAPI y cubriéndolas con cubreobjetos. Por último, capture imágenes con un microscopio confocal.

Para medir el ancho del proceso, use la herramienta de lupa para elegir un área de la sección donde se están gestando los procesos, como la capa nuclear externa. A continuación, elija un campo óptico en el que dichos procesos sean visibles y continuos. Haga clic en la herramienta Analizar en el menú principal y, a continuación, haga clic en Establecer escala en el submenú para establecer la barra de escala de acuerdo con la configuración microscópica.

Seleccione la función de línea en el menú principal y dibuje una línea a lo largo del proceso. Haga clic en analizar en el menú principal y, a continuación, haga clic en medir en el submenú para realizar la medición. Para analizar la continuidad del proceso, regrese al menú principal y use la función de polígono para seleccionar la capa plexiforme interna como la región de interés.

Mida el área haciendo clic en analizar y, a continuación, mida. Haga clic en procesar, filtrar y, a continuación, en variantes, para mejorar los bordes de la imagen reemplazando cada píxel por su variante de vecindad. A continuación, ajuste automáticamente el contraste y el brillo haciendo clic en imagen, ajustar, brillo y contraste, y luego automático en el submenú.

A continuación, cuenta las líneas. En estas imágenes, la inmunorreactividad de IGG se ve en rojo. En los grupos de control, la IGG está restringida dentro de los vasos sanguíneos.

En el grupo de la histamina, la IGG se detecta fuera de los vasos sanguíneos, donde forma nubes de fuga indicadas por círculos punteados. En los grupos tratados con LXA4, la IGG vuelve a estar restringida dentro de los vasos sanguíneos. La adición adicional de LXA4 rescata la función de los vasos inducida por la histamina.

Este histograma muestra el porcentaje de vasos sanguíneos con fugas en los grupos analizados. En estas imágenes se presenta la inmunotinción para GFAP, que tiñe las células de Müller. La tinción positiva se obtiene en los procesos de las células de Müller, a través de la retina y alrededor de los vasos sanguíneos.

Se presenta el ancho de los procesos de la célula Müller, de todos los grupos. El tratamiento con histamina, o LXA4 solo, redujo el ancho del proceso. Pero cuando se aplicaron ambos reactivos juntos, se rescató el ancho del proceso.

En estas imágenes, se presenta la inmunotinción para MAP2. Se observa tinción positiva de los procesos y cuerpos celulares de las células ganglionares. Se presenta la densidad de los procesos ganglionares positivos MAP2 continuos de todos los grupos.

El tratamiento con histamina disminuye la continuidad de los procesos dendríticos, mientras que LXA4 no tiene efectos significativos. Una vez dominado, este experimento se puede realizar en tres a cinco días, si se realiza correctamente, con cinco minutos por retina para la disección, seis minutos para el tratamiento, seguido de seccionamiento, inmunotinción y análisis. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar tejido fresco y controles adecuados.

Después de este procedimiento, se pueden agregar otros métodos, como imágenes en vivo, para rastrear los cambios en tiempo real en los niveles de calcio y las propiedades mitocondriales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar este modelo de cultivo de retina agudo ex vivo, para crear una disfunción de BRB, para evaluar el daño y para detectar posibles medicamentos. Muchas gracias por mirar y todo lo mejor con tus experimentos.