Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

O objetivo geral deste projeto multidisciplinar é isolar os mecanismos específicos pelos quais o resíduo de fungicida no pólen pode causar declínios de colônias em abelhas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave relacionadas à alta mortalidade entre as larvas de zangões afetadas pela interrupção mediada por fungicidas das simbioses dos micróbios das abelhas. A principal vantagem dessa técnica é que ela investiga o efeito indireto dos fungicidas nas abelhas, rastreando a demografia das abelhas ao lado de mudanças nas comunidades microbianas no pólen das abelhas.

Embora esses métodos forneçam informações sobre a saúde das abelhas nativas, eles também podem ser aplicados a outros polinizadores, como as abelhas, que desempenham um papel crítico na polinização das culturas em todo o mundo, enfatizando assim a aplicação inteligente de fungicidas nas culturas com flores. Demonstrando os procedimentos neste estudo colaborativo estarão Prarthana Dharampal, Luis Diaz-Garcia e Caitlin Carlson. Para começar, monte gaiolas de malha em um campo plantado com aveia.

Prepare um por replicação. Planeje fazer pelo menos 10 para um único experimento de tratamento. Primeiro cave uma trincheira ao redor de cada gaiola e cave todas as quatro bordas da gaiola de malha no chão para garantir que as abelhas não possam escapar.

Em seguida, abasteça as gaiolas com plantas com flores em vasos que são conhecidas por serem atraentes para as abelhas, como trigo sarraceno, borragem, alyssum, cosmos e girassóis. Complemente também cada gaiola com uma única bandeja de trevo em flor. Agrupe todos os recursos florais em um canto da gaiola, ocupando cerca de 2,5 metros quadrados.

Vegetar a área restante da superfície da gaiola com aveia. Antes de carregar as colônias nas gaiolas de campo, certifique-se de que cada uma contenha operárias e uma única rainha. Em seguida, carregue uma colônia por gaiola por um período de 29 dias.

Na gaiola, oriente as caixas da colônia de forma que as aberturas da colônia apontem para o sul para fornecer às abelhas condições ideais de navegação. Em seguida, aplique o tratamento experimental em metade das gaiolas. Neste caso, use um pulverizador de pesticidas portátil para aplicar fungicida à base de clorotalonil em um nível relevante de campo para as plantas com flores.

Este tratamento é aplicado no dia zero e novamente no dia 13. Cubra as flores uniformemente, de modo que nenhum líquido adicional adira às superfícies florais. No final do período de estudo, remova as colônias das gaiolas e anestesie as abelhas, colocando-as em um freezer de 20 graus Celsius negativos por 20 minutos.

Uma vez anestesiadas, remova as abelhas usando uma pinça estéril e registre o número de larvas, pupas, fêmeas adultas e machos adultos e a Rainha Mãe. Em seguida, use uma balança analítica e registre o peso seco da Rainha Mãe e de outras classes de abelhas. Para começar, pulverize o pólen comprado comercialmente em um pó fino usando um moinho de bolas de laboratório padrão.

Em seguida, para esterilizar o pólen em pó, mergulhe-o em etanol a 70%. Deixe o etanol evaporar durante a noite sob luz ultravioleta em um gabinete de biossegurança. No dia seguinte, verifique a esterilidade do pólen colocando uma pequena quantidade em meio de ágar de uso geral usando palito estéril.

Incube a placa a 28 graus Celsius por 48 horas e use-a apenas se não houver crescimento. Em seguida, usando pipetas estéreis, adicione uma dose de fungicida relevante para o campo ao pólen esterilizado e misture bem os dois usando palitos de madeira estéreis. Use água estéril para controle.

Agora prepare as colmeias para o experimento em tamanhos de amostra de pelo menos três. Diariamente, prepare asepicamente as alíquotas de pólen para cada colmeia. Em seguida, através do alçapão na caixa que envolve cada colmeia, introduza o pólen.

Além do pólen, forneça semanalmente a cada colmeia uma solução de açúcar esterilizada. Realize este regime de alimentação por quatro semanas. Como antes, anestesiar as urticárias no final do período de teste.

Em seguida, abra e exume o conteúdo da toca com muito cuidado sem deixar o pólen ou as abelhas larvais caírem mais fundo no ninho. Realize as mesmas métricas de contagem e pesagem para a colmeia de antes, mas também raspe as provisões de pólen contidas nas câmaras de cria usando uma pinça esterilizada. Colete o pólen em tubos estéreis e armazene-o a 80 graus Celsius negativos para análise posterior.

Os dados obtidos nos experimentos em gaiolas mostraram que as colônias de abelhas tiveram uma resposta significativa à exposição ao fungicida. As colmeias tratadas com fungicida produziram significativamente menos operárias do que as colmeias de controle. A biomassa total também foi reduzida em colmeias tratadas com fungicidas, incluindo a massa da Rainha Mãe.

Em seguida, o número e a massa de larvas, pupas e machos adultos não foram afetados. Os experimentos baseados em laboratório espelharam os resultados baseados em campo. Tomados em conjunto, esses resultados são consistentes com os resultados publicados anteriormente e indicam que a exposição a fungicidas afeta a aptidão da colônia.

Nossos dados mostram que a diversidade e a equitabilidade microbiana foram reduzidas nas colmeias tratadas com fungicida. A análise metagenômica das provisões de pólen foi usada para analisar as mudanças nas comunidades microbianas de colmeias tratadas com fungicidas. Houve uma enorme diminuição na abundância de Streptomycetales e Enterobacteriales comumente isolados nas colmeias tratadas com fungicidas, enquanto os membros bacterianos da ordem Rickettsiales, que inclui patógenos comuns de artrópodes, estavam em abundância muito maior nas colmeias tratadas com fungicidas.

As colmeias tratadas com fungicida também apresentaram menor abundância de fungos pertencentes às ordens Eurotiales, Sordariales e Saccharomycetales, ao mesmo tempo em que aumentaram a abundância de fungos nas ordens Capnodiales e Ascosphaerales. Esses resultados indicam que os fungicidas podem alterar o microbioma das provisões de pólen, interrompendo efetivamente a simbiose entre micróbios de abelhas e comprometendo a saúde das abelhas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar abelhas no campo, dissecar ninhos de abelhas e identificar as comunidades microbianas de provisões de pólen de abelhas, avaliando assim o papel dos fungicidas na saúde das colônias de abelhas.

Uma vez dominadas, essas técnicas podem ser usadas para demonstrar a interrupção mediada por fungicidas do microbioma polínico e seu efeito indireto na saúde geral das colônias de abelhas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter condições assépticas durante a preparação das refeições de pólen para evitar infecções e infestações. Seguindo este procedimento, a descrição da estrutura da comunidade microbiana pode ser melhorada relaxando a fração das diferenças totais entre as sequências e reduzindo o número de táxons mesclando aqueles com baixa abundância relativa.