青贮的宏基因组学分析
January 13th, 2017
Metagenomics 用于研究青贮牛饲料的微生物组。通过鸟枪法测序进行分析。这种方法用于表征牛饲料中微生物群落的组成。
本实验的总体目标是了解青贮饲料样品中存在的细菌群落，尽管这些程序可以应用于一系列不同的样品类型。在识别复杂微生物系统中发现的原核生物群落时，这种方法可以帮助回答关键问题，例如在这里介绍的案例中，用于动物饲料的青贮饲料。该技术的主要优点是采用鸟枪法测序，而不是更传统的 16S 扩增子测序，从而在微生物组分类时获得更高的准确性。
该方法可应用于可能形成复杂微观世界的各种其他样品，例如人体肠道、皮肤表面、水样，甚至办公室咖啡机周围。使用市售试剂盒从青贮饲料样品中提取 DNA。在提供的裂解管中，将 100 至 400 毫克样品加入 978 微升磷酸钠缓冲液和 122 微升土壤裂解缓冲液中，开始此程序。
包括一个没有青贮饲料样品的阴性对照。将裂解管以每秒 6.0 米的速度放入均质器中 40 秒，使样品均质化。将裂解物离心 15 分钟。
将上清液转移至含有 250 μL 蛋白质沉淀溶液的干净微量离心管中，并倒置 10 次混合溶液。然后离心 5 分钟。将上清液转移至含有 1 mL DNA 结合基质的干净 15 mL 离心管中。
通过不断倒置试管 3 分钟来混合溶液。让混合物静置 3 分钟，然后弃去 500 μL 上清液，并通过移液混合剩余的上清液。将 600 微升悬浮液转移到离心过滤器中，并以 14， 000 倍 G 离心 1 分钟。
弃去滤液，用剩余的悬浮液重复该过程。弃去滤液后，向离心过滤器内的 DNA 结合基质中加入 500 μL 洗涤缓冲液，通过移液混合，并以 14， 000 倍 G 离心 1 分钟。弃去滤液，将离心过滤器离心 2 分钟，以确保去除所有洗涤缓冲液。
在 23 摄氏度下干燥离心过滤器 5 分钟。向 DNA 结合基质中加入 100 μL 预热的不含 DNase 的水，并将离心过滤器转移到干净的 1.5 mL微量离心管中。以 14， 000 倍 G 离心 1 分钟以洗脱 DNA。
将 DNA 储存在零下 20 摄氏度，直到需要进一步分析。从青贮饲料样品中提取的 DNA 将使用 DNA 纯化珠进行纯化。从冰箱中取出珠子，并在使用前至少 23 分钟将其置于 30 摄氏度。
向每个 DNA 样品中加入 2 体积的磁珠，并在 23 摄氏度下孵育溶液 5 分钟。将样品放在分离磁力架上 5 分钟，然后弃去上清液。用 200 微升新鲜的 80% 乙醇洗涤珠子两次。
将珠子风干 10 分钟珠子需要充分干燥，但不能过度干燥，因此在继续之前目视检查珠子至关重要。从分离磁力架中取出样品，加入 50 μL 洗脱缓冲液，然后通过移液混合。将悬浮液在 23 °C 下孵育 5 分钟，然后将样品放回分离磁力架上 3 分钟。
将含有 DNA 的上清液转移到干净的试管中，弃去珠子。要开始此过程，请使用缓冲液与试剂的 199：1 比例制备工作溶液。将 10 μL 每种 DNA 标准品加入 190 μL 工作溶液中。
将 10 μL 纯化的 DNA 添加到 190 μL 的工作溶液中。将标准品和 DNA 样品在 23 摄氏度下孵育 2 分钟。随后，按照屏幕上的说明，在荧光计上分析 DNA 样品之前分析标准品。
纯化的 DNA 必须具有良好的质量并准确定量，因此如果对 DNA 的质量和浓度有任何疑问，则必须重复提取 DNA。鸟枪法测序文库使用市售文库制备试剂盒制备。使用洗脱缓冲液将 DNA 样品稀释至 0.2 ng/μL。
将 5 μL 纯化的 DNA 与 10 μL 酶tagmentation 缓冲液和 5 μL 酶tagmentation enzyme 混合物混合。将样品在 55 摄氏度下孵育 5 分钟。向每个样品中加入 5 微升中和缓冲液，并在 23 摄氏度下孵育溶液 5 分钟。
接下来，添加 5 μL 的每种样品特异性测序索引和 15 μL 的 PCR 预混液。将样品放入热循环仪中并进行 PCR。如前所述，使用磁珠纯化方法纯化制备的 DNA，但最终洗脱 30 μL 洗脱缓冲液。
随后，对 DNA 进行测序，并使用一系列生物信息学工具分析序列数据，如文本方案中所述。使用 Kracken 软件对细菌微生物组进行分类，然后使用 CHROMA 软件进行可视化。青贮饲料宏基因组中存在的大多数细菌种类存在于四个原核丝中，厚壁菌门（34%）放线菌门（28%）变形菌门（27%）和芽孢杆菌（7%）还显示了这些丝中存在的类别的分布。
对组装的读数进行功能注释，结果是 6， 357 个预测蛋白质被注释为假定的碳水化合物活性酶和构成碳水化合物活性酶数据库的五种酶类别之一。该维恩图显示了蛋白质注释的分布，包括包含多个酶类注释的注释。其中，3， 591 预测具有糖苷水解酶活性。
一旦掌握，如果作得当，DNA 测序文库的制备可以在一天内完成。在尝试此程序时，重要的是要确保样品之间没有交叉污染，并始终使用合适的对照，例如空白。按照此程序，可以进行其他 biofomatic 分析，以验证 Kracken 所做的分类。
这些宏基因组技术使研究人员能够探索许多复杂系统中的微生物组。观看本视频后，您应该对如何制备宏基因组 DNA 测序文库和对获得的 DNA 序列读数进行生物信息学分析有很好的了解。不要忘记，使用 DNA 结合试剂可能非常危险，因此在执行此程序时应始终佩戴手套和实验室外套等预防措施。
概述
本研究采用宏基因组学方法，通过shotgun测序分析青贮牛饲料的微生物群。该方法可以对饲料中存在的微生物群落进行详细的表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 宏基因组学
- 动物营养学
背景
- 了解青贮中的细菌群落对于动物饲料质量至关重要。
- Shotgun测序比传统方法提供更高的准确性。
- 该方法可以应用于各种复杂的微生物系统。
- 商业试剂盒可促进从青贮样品中提取DNA。
研究目的
- 调查青贮样品中的细菌群落。
- 提高微生物群分类的准确性。
- 探索shotgun测序在不同样品类型中的应用。
使用的方法
- 使用商业试剂盒和特定缓冲液提取DNA。
- 通过标记化进行shotgun测序文库制备。
- 使用Kracken和CHROMA软件进行生物信息学分析。
- 对与碳水化合物活性酶相关的蛋白质进行功能注释。
主要结果
- 识别了青贮微生物群中的四大主要原核生物门类。
- 功能注释揭示了6,357个预测蛋白。
- 预测了3,591个蛋白具有糖苷水解酶活性。
- 展示了分类学分类和蛋白质注释的可视化。
结论
- Shotgun测序为青贮微生物群提供了全面的视角。
- 该研究增进了对动物饲料中微生物群落的理解。
- 研究结果可以为未来关于复杂微生物系统的研究提供信息。
