Derivazione delle Culture leptomeningi Explant da Postmortem cervello umano donatori

Sono Birgitt Schule, direttrice del programma di donazione del cervello presso il Parkinson's Institute and Clinical Center. In questo video, descriviamo una tecnica per l'espiantazione di una coltura cellulare e la durata del fibroblasto primario da leptomeningi di cervello umano post mortem da pazienti con malattia di Parkinson. Questi fibroblasti possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni, compresi i saggi basati su cellule.

Questo è importante, perché possiamo studiare linee cellulari da casi provati dall'autopsia di malattia di Parkinson sporadica con patologia a corpi di Lewy. Iniziare posizionando tutti i materiali necessari nella cappa di coltura tissutale. Tutti gli oggetti che entrano nella cappa devono essere spruzzati con etanolo al 70% e puliti.

Il primo passo è trasferire le meningi dal tubo al piatto di taglio. Inizia versando circa 10 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato in un piatto da taglio sterile da 10 centimetri. Qui puoi vedere le meningi.

Utilizzando una pinza sterile, trasferire con cura le meningi nel piatto da taglio. Eseguire questo passaggio lentamente per evitare strappi. Il passo successivo è lavare le meningi in PBS per rimuovere quanto più sangue possibile.

Se il tuo campione è troppo sanguinante, potresti prendere in considerazione l'idea di trasferirlo su un altro piatto da taglio. Aggiungere altri 10 millilitri di PBS in un piatto fresco di 10 centimetri. Ripetere questo lavaggio per continuare a rimuovere il sangue dalle meningi.

Infine, trasferite le meningi in un piatto fresco di 10 centimetri contenente PBS. Al termine, coprire il piatto e trasferirlo al microscopio da dissezione nella cappa a flusso laminare. Il passo successivo consiste nel continuare a sezionare le meningi in pezzi più piccoli.

Usando due bisturi sterili, separa delicatamente i vasi sanguigni dalle meningi con un movimento raschiante superficiale. Prepara una regione abbastanza grande da tagliare circa 18 pezzi da 3 millimetri per 3 millimetri, come mostrato in questa immagine. Quindi, prendi il bisturi e, con un movimento a dondolo, seziona la regione preparata in pezzi di 3 millimetri per 3 millimetri.

È più facile farlo in un processo graduale tagliando prima le meningi in pezzi più grandi e poi tagliando quei pezzi in sezioni più piccole. Coprire il piatto di taglio e trasferirlo nuovamente nella cappa di coltura tissutale. Successivamente, preparati a trasferire le meningi in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti che è stata ricoperta con 1 millilitro di gelatina allo 0,1% per 30-60 minuti.

Aggiungere un millilitro di terreno di coltura per meningi in ciascun pozzetto. Quindi, con una pinza sterile, trasferire tre o quattro pezzi di meningi al centro di ciascun pozzetto. Le cellule coltivate su questa piastra saranno un passaggio zero.

La fase successiva utilizza vetrini coprioggetti per garantire che i pezzi di meningi siano fermi e rimangano a contatto con la piastra di coltura. Posizionare un vetrino coprioggetti circolare sterile da 15 millimetri sui pezzi di meningi. Se necessario, riposizionare i pezzi di meningi con un vetrino coprioggetti.

Quindi, utilizzando la pinza, premere con decisione sul vetrino coprioggetti per assicurarsi che i pezzi tocchino la piastra. Questa immagine mostra i pezzi di meninge tenuti in posizione con un vetrino coprioggetti. Posizionare il coperchio sulla piastra a sei pozzetti e trasferire con cura la piastra in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo due giorni di coltura, aggiungere un ulteriore millilitro di terreno di coltura fresco a ciascun pozzetto. A sette giorni, aspirare il supporto. Quindi, riempire ogni pozzetto con 2 millilitri di terreno fresco.

Dopo il settimo giorno, continuare a rifornire i pozzetti con 2 millilitri di terreno fresco a giorni alterni. Questa immagine mostra il giorno iniziale dei pezzi di meningi e della cultura al microscopio invertito. Dopo circa sei-nove giorni, si può osservare l'attaccamento cellulare nella prima escrescenza.

Tra i 15 e i 19 giorni, il numero di cellule aumenta e la crescita diventa più densa. I fibroblasti meningei sono caratterizzati dall'espressione di fibronectina. Queste immagini mostrano cellule meningee in coltura che sono state colorate e sono positive per la fibronectina.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come derivare le colture di espianti di leptomeningi da donatori di cervello umano post mortem. Questa tecnica fornisce un modo semplice e robusto per derivare i fibroblasti meningei entro tre-sei settimane e consente di conservare da 15 a 20 milioni di cellule con un basso numero di passaggi.