Genoma-ancha análisis de inhibidor de HDAC mediada por modulación de microRNAs y mRNAs en células B inducida por recombinación del ADN someterse a interruptor de clase y diferenciación de células plasmáticas

El objetivo general de este experimento es inducir a los linfocitos B a experimentar el cambio de clase de anticuerpos y la diferenciación de células plasmáticas y analizar la modulación, así como la regulación epigenética mediante la expresión de ARNm y microARN inhibidores de HDAC en células B. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la respuesta de anticuerpos de células B, como la modulación epigenética del cambio de clase de inmunoglobulinas y la diferenciación de células plasmáticas. La principal ventaja de esta técnica es proporcionar un método sencillo para modular las funciones de las células B y definir la alteración de microRNAs y mRNAs por reguladores epigenéticos.

Después de sacrificar a un ratón C57BL6J libre de patógenos específicos y esterilizar la piel de acuerdo con el protocolo de texto, use pinzas esterilizadas en autoclave y tijeras de disección para cortar la piel justo debajo de la caja torácica para visualizar el bazo en el lado izquierdo del abdomen, justo debajo del hígado. Pinza suavemente el bazo y corta todo el tejido conectivo antes de extraer el órgano. A continuación, coloque el bazo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 1.000 microlitros de medio RPMI 1640 completo.

A continuación, inserte un filtro de células de 70 micras en un tubo de centrífuga cónica de polipropileno de 50 mililitros y vierta el bazo del tubo de microcentrífuga en el filtro de células. Use la punta de un tubo de centrífuga cónica de polipropileno de 15 mililitros para engranar suavemente el bazo a través del colador. Luego, con 15 a 20 mililitros de medio completo, enjuague el colador.

Gire las celdas a 350 x G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante. Utilice un mililitro de tampón de lisis ACK para volver a suspender el pellet de células e incubar durante un minuto.

Luego agregue cuatro mililitros de ACK e incube la suspensión para eliminar los glóbulos rojos de la suspensión del bazo durante cuatro minutos adicionales a temperatura ambiente con agitaciones ocasionales. Luego agregue 25 mililitros de medio completo para apagar la reacción de lisis. Gire las celdas a 350 x G durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante y agregue un mililitro de medio completo para volver a suspender el pellet de celda. Luego, con un hemocitómetro, cuente las células viables. En un tubo redondo estéril de poliestireno de cinco mililitros, prepare una suspensión de 0,25 a dos mililitros de 1 x 10 a la octava célula por mililitro en medio completo.

Agregue suero de rata normal a la muestra. A continuación, agregue 50 microlitros por mililitro de cóctel de aislamiento al tubo. A continuación, mezcle las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces e incube la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Agregue 75 microlitros por mililitro de partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina al tubo. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces e incubar la muestra a temperatura ambiente durante dos minutos y medio. Lleve el volumen hasta 2,5 mililitros con el medio RPMI 1640 completo y pipetee suavemente dos o tres veces para mezclar.

Coloque el tubo abierto en el imán e incube a temperatura ambiente durante dos minutos y medio. A continuación, vierta el sobrenadante que contiene células B intactas en un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Use azul de tripán y un hemocitómetro para contar las células.

Vuelva a suspender las células B purificadas en medio RPMI 1640 completo a una concentración final de 0,3 x 10 por la 6ª célula por mililitro. Luego, a los pocillos de una placa de 48 pocillos, agregue un mililitro de células B purificadas a un 0,3 x 10 a la sexta celda por mililitro tres microgramos por mililitro de LPS de E. Coli, cinco nanogramos por mililitro de IL4 y cero o 500 micromolares de IDH. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 60 horas para QRT, PCR y análisis de secuenciación de ARNm y miARN de alto rendimiento o 96 horas para análisis de citometría de flujo.

Después de 96 horas de cultivo, separe las células de cada pocillo pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo varias veces. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego, usando una centrífuga de sobremesa, gire las celdas a 350 x G durante cinco minutos.

Luego, desecha el sobrenadante. Mezcle un cóctel de tampón HBSS y los siguientes reactivos, 1 % de BSA, 0,5 nanogramos por mililitro de anticuerpo IgM conjugado contra el ratón de cabra, 0,2 nanogramos por mililitro de anticuerpo monoclonal IgG1 conjugado contra ratas, 0,2 nanogramos por mililitro de anticuerpo monoclonal B220 conjugado contra ratas conjugadas, 0,2 nanogramos por mililitro de anticuerpo monoclonal CD138 anti-ratón de rata conjugado con PE-Cy7 y dos nanogramos por mililitro de 7-AAD. Incuba las células en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, utilice un mililitro de HBSS con 1%BSA para lavar las células. Utilice una centrífuga de sobremesa para centrifugar las celdas a 1.500 x G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, use 300 microlitros de HBSS con 1% de BSA para volver a suspender las células y transferir la suspensión celular a un tubo de poliestireno de fondo redondo.

Cubra el tubo con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Para llevar a cabo el análisis QRT PCR del ARNm, incluya el paso de tratamiento de la ADNasa 1. A continuación, utilice un kit comercial de aislamiento de ARN total que pueda recuperar ARN pequeño para extraer ARN de 0,2 a 5 x 10 a la sexta célula, siguiendo las instrucciones del fabricante.

Después de sintetizar el ADNc y realizar la PCR QRT en el ARNm, lleve a cabo la RT PCR para microARN utilizando una mezcla maestra de PCR en tiempo real verde cibernético mediante descongelación a temperatura ambiente, 2 mezclas maestras de PCR, cebadores directos específicos de miARN de 250 nanomolares y un cebador inverso universal. Después de preparar una mezcla de reacción de 25 microlitros de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 22,5 alícuotas de microlitros por pocillo a una placa de PCR de 96 pocillos. A continuación, añada 2,5 microlitros de ADNc molde a los pocillos individuales.

Selle herméticamente la película de la placa. A continuación, centrifugar la placa a 1.000 x G a temperatura ambiente durante un minuto. Coloque la placa en el ciclador en tiempo real e inicie el programa de ciclado que se encuentra en el protocolo de texto.

Utilizando el protocolo demostrado en este vídeo, las células B purificadas incubadas sin PS NIL4 durante 96 horas pueden inducir entre un 30 y un 40% de CSR a IgG1 y aproximadamente un 10% de diferenciación de células plasmáticas. Después del tratamiento con HDI, la CSR a IgG1 disminuyó a 10 a 20%mientras que la diferenciación de células plasmáticas disminuyó a aproximadamente 2%La inhibición mediada por HDI de CSR se confirmó aún más por la disminución del número de transcripciones de I mu C gamma 1 y VHDJHC gamma 1 después de la recombinación. Medido por QRT PCR, se demostró que la expresión de Aicda, que es crítica para CSR SHM y Prdm1 y Xbp1, que son importantes para la diferenciación de las células plasmáticas, es inhibida por el VPA.

Según lo medido por la secuenciación de ARNm de las células B estimuladas sin PS Nil4, solo el 0,3% de estos ARNm altamente expresados fueron regulados al alza por HDI más del doble y solo el 0,36% de los ARNm altamente expresados, incluidos Aicda, Prdm1 y Xbp1 fueron reducidos por HDI más del 50%El análisis de secuenciación de miARN del perfil de miARN en células B tratadas con HDI o Nil, mostró que los HDI regulan selectivamente al alza Aicda y Prdm1 dirigiéndose a los miARN. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro horas y media o cinco horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener un entorno de trabajo estéril.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir a las células B a experimentar un cambio de clase y diferenciación de células plasmáticas y modular estas funciones mediante reguladores epigenéticos.