בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור במבחנה Decidualization

המטרות הכלליות של הליך זה הן לבודד ולתרבית תאי רירית הרחם העכבריים, הסטרומה והאפיתל הראשוניים של העכבר עבור התרבות המשותפת שלהם לחקר דצידואליזציה במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת הרבייה כגון מהו האיתות הפרקריני בין תאי אפיתל ותאי סטרומה במהלך תהליכים חשובים כמו דצידואליזציה ופלישת טרופובלסטים, וכיצד מווסת מסלול איתות זה. ניתן להשתמש בטכניקות אלה כדי לחקור את תהליך הדצידואליזציה במערכת קו-תרבות אפיתל וסטרומלית.

על ידי שימוש במערכת זו, אתה יכול להעריך אם מולקולות איתות המופרשות על ידי אחד משני התאים יכולות להשפיע על תהליך זה. לפני קצירת הרחם, בצע בדיקת מריחה נרתיקית כדי לבדוק את שלבי המחזור של בעלי החיים. כדי לבחור רק עכברים בשלב הייחום.

כפי שמאופיין בנוכחות תאי אפיתל בקרנית בשטיפת הנרתיק. לאחר מכן, השתמש במלקחיים ובמספריים כדי לפתוח את הבטן של חיית הייחום הראשונה ולהחזיר את המעיים הצידה כדי לדמיין את שתי קרני הרחם. לתפוס קרן אחת בקצה המרוחק ביותר, מתחת לחצוצרה, לנתח את רקמת הרחם מהחצוצרה באמצעות מלקחיים לניתוח, ומלקחיים מספר חמש של דומונט כדי להסיר את רקמות השומן והחיבור.

לאחר מכן, הסר את הקרן בקצה הדיסטלי, מעל גוף הרחם. לאחר הסרת קרני הרחם, הניחו אותן בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר עם שלושה מיליליטר HBSS. לאחר איסוף כל קרני הרחם, העבירו את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו, והשתמשו במלקחיים כדי להסיר שאריות שומן ורקמות חיבור.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים מספר חמש של דומונט, ניתוח מלקחיים ומספריים קפיציים קטנים, פתחו את קרני הרחם לאורך כדי לחשוף את הלומנים שלהם, ושטפו את הרקמות בצלחת פטרי חדשה המכילה HBSS טרי. כעת, העבירו את כל הקרניים לצינור של 15 מיליליטר המכיל פנקראטין וטריפסין. ולדגור את הרקמות אופקית במשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס ו-50 סל"ד על שייקר מסלולי.

בסוף השעה, העבירו את הצינור לספסל למשך 45 דקות דגירה אופקית ללא טלטול, ואחריה דגירה אופקית של 15 דקות ללא טלטול באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה של אמבט המים, יש לנקנק בזהירות את הסופרנטנט ולהעביר את הרחם לצלחת פטרי המכילה מדיום תאי אפיתל רירית הרחם של העכבר למשך חמש דקות כדי להשבית את פעילות הטריפסין. לאחר מכן, העבירו את הרקמות לצינור של 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של HBSS קר, ומערבלו את הרקמות למשך 10 שניות כדי לשחרר את יריעות האפיתל.

לאחר מכן, שטפו את הרחם בצלחת פטרי חדשה המכילה שלושה מיליליטר של HBSS טרי, ואספו שני תרחיפי יריעות אפיתל נוספים בשני צינורות חדשים של 15 מיליליטר כפי שהודגם זה עתה. לאחר מערבולת הרקמה השלישית, העבירו את הרחם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל תערובת עיכול תאי סטרומה של רירית הרחם של העכבר לדגירה של 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד. שחזר את יריעות האפיתל על ידי פיפטינג של שלושת תרחיפי התאים בעדינות דרך רשת ניילון של 100 מיקרון כדי להסיר את פסולת הרקמות, ולאחר מכן צנטריפוגה של תרחיף התאים שנוצרו.

השעו מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של מדיום תאי אפיתל רירית הרחם של העכבר עם ערבוב יסודי, ואז אפשרו לתמיסה להתיישב למשך חמש דקות כדי להפריד את תא הסטרומה של רירית הרחם שנותר על ידי כוח הכבידה. בתום המשקעים, השתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להסיר בזהירות את שני המיליליטר העליונים של הסופרנטנט, ולצנטריפוגה את התאים שנאספו. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור האפיתל של העכבר במדיום אפיתל עם פיפטינג עדין.

וצלחת את התאים על החלקות כיסוי מצופות קולגן בצפיפות המתאימה לניתוח המתוכנן במורד הזרם. לאחר בידוד תאי האפיתל, המשך עם תאי הסטרומה והסר את צינור העיכול של תאי הסטרומה של העכבר עם הרחם מהחממה. לאחר 30 דקות דגירה, כפי שהודגם זה עתה, יש לנער בעדינות את הצינור ביד למשך 10 שניות, ולהעביר את הרחם לצלחת פטרי המכילה שלושה מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס HBSS.

שטפו היטב את הרקמות, ואז הוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום תאי סטרומה לצינור העיכול כדי להשבית את פעילות הטריפסין, והעבירו את הרחם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של מדיום תאי סטרומה טריים של רירית הרחם של העכבר. יש לנער את שפופרת הממחטה בעדינות למשך 10 שניות. לאחר מכן, העבירו את הרחם לצלחת של HBSS קר, ואחריה העברתם לצינור חדש של 15 מיליליטר של מדיום תאי סטרומל.

לאחר שטיפת רקמה שלישית, והעברה, דגרו את רקמות הרחם בתערובת עיכול תאי סטרומה טריים של רירית הרחם של העכבר למשך 30 דקות ודגירה של 37 מעלות צלזיוס. בתום העיכול, העבירו את תרחיפי התאים מצינור אחד לשלוש ואת צינור הטריפסין דרך רשת ניילון של 40 מיקרון ושטפו את הרשת בחמישה מיליליטר נוספים של מדיום תאי רירית הרחם של העכבר. לאחר מכן, אסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה.

ולהשעות מחדש את הגלולה במדיום תאי רירית הרחם הטריים של העכבר לציפוי על החלקות כיסוי מצופות פוליליזין בצפיפות המתאימה לניתוח המתוכנן במורד הזרם. ניתן להעריך את טוהר תרביות התאים הראשוניות על ידי ההבדלים בביטוי וימנטין וציטוקרטין, שכן רמות הווימנטין גבוהות בתאי סטרומה של רירית הרחם של העכברים, ונמוכות בתאי אפיתל רירית הרחם של העכברים. בעוד שרמות הציטוקרטין גבוהות בתאי אפיתל רירית הרחם של העכברים, ונמוכות בתאי סטרומה של רירית הרחם של העכברים.

הצביעה הכפולה של מנטין/ציטוקרטין ממחישה עוד יותר את ביטוי המנטין על ידי תאי סטרומל, כמו גם את הביטוי הבלעדי של ציטוקרטין על ידי תאי האפיתל. השראת הדצידואליזציה בתרביות תאי סטרומה על ידי יישום אדנוזין מונופוספט מחזורי ו-MPA, מגלה כי רמות ה-MRNA של פרולקטין מוגברות באופן דרמטי לאחר חמישה ימי טיפול בהשוואה לתרביות תאי סטרומה מבוקרות. מכיוון שקשה לדמיין את תאי האפיתל בתוספות תרבית תאים צדדיות, ניתן לבצע בדיקת כדאיות מיד לאחר סימולציית דצידואליזציה של חמישה ימים, עם שינוי צבע מכחול לוורוד בוהק המצביע על נוכחות של תאי אפיתל ברי קיימא.

בעקבות טכניקה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מבחני הידבקות בלסטוציסט, על מנת להעריך האם גורמים המופרשים על ידי תאי האפיתל בנוכחות בלסטוציסט יכולים לגרום לדצידואליזציה של תאי סטרומל.