Name: Non-invasive In Vivo Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda imagem óptica fluorescente não invasiva in vivo para visualizar atividade de MMPs em modelos inflamatórios usando sondas ativáveis. Este método rápido e acessível auxilia no estudo de mecanismos biológicos subjacentes.

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Agradecemos a Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay para excelente suporte técnico. Agradecemos Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran para a edição do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation e da Faculdade de Medicina da Universidade Eberhard Karls de Tübingen ( &#39;&#39; Promotionskolleg &#39;&#39;) e pela DFG através da CRC 156 (C3 projeto).

Todos os procedimentos descritos neste documento, seguiu as diretrizes e normas internacionais do cuidado e uso de animais de laboratório e foram aprovados pelo Bem-Estar Animal e Comitê de Ética local do país Comissão Tuebingen, Alemanha. 8 - 12 semanas de idade BALB / c e C57BL / 6 murganhos foram mantidos num ciclo de 12 h: 12 h luz: ciclo escuro e foram alojados em IVCS e condições ambientais padronizadas a 22 ± 1 ° C em grupos de 2-5 com água e alimentos ad libitum acesso. 1. Preparação de Material <ol><li> Dilui-se o corante OI para imagiologia de fluorescência no infravermelho próximo de acordo com a respectiva folha de dados directamente antes da injecção. O corante OI activável (sonda comercial com uma excitação a 680 nm) para medir as MMPs in vivo, está pronto para usar, a uma concentração de 20 nmol em 1,5 mL de 1x PBS. Agitar suavemente a solução ou vortex antes da utilizao. OI corante pode ser armazenado a 2 - 8 ° C durante até 6 meses quando protegida da luz. </li&gt; <li> Para injecções intravenosas ( iv ) preparar um cateter venoso. Use uma seringa de insulina de 20 U (0,5 mL) cheia com solução salina a 0,9% (contendo 10 unidades de injeção de heparina em 50 mL) e uma agulha de calibre 30 conectada a um cateter de polietileno. Injectar a dose recomendada de 2 nmol por rato do corante OI. </li></ol> 2. Indução da Artrite Reumatóide e da Reação de Hipersensibilidade de Contato Crônico <ol><li> Artrite reumatóide: <ol><li> Diluir 100 μL de soro (obtido de ratinhos K / BxN 10 ) contendo anticorpos (AB) contra glucose-6-fosfato isomerase (GPI) 1: 1 com 1x PBS (200 μL) para induzir RA. Armazenar o soro diluído a -80 ° C. Os procedimentos detalhados para a indução da AR são descritos por Monach et al. 8 . </li><li> Para induzir RA, levantar cada rato suavemente pela sua cauda e injectar 200 μL do soro diluído intraperitoneal ( ip ) no dia 0 de tEle experimenta. Após a injeção, coloque o mouse diretamente em sua gaiola. </li><li> Opcionalmente, medir os diâmetros do tornozelo de cada tornozelo, antes de injeções de AB e definir uma &quot;pontuação artrítica&quot; ( Figura 1A ). Continuar a medição do inchaço do tornozelo diariamente até ao dia 6 após GPI-soro utilizando um dispositivo mecânico de medição (micrómetro). </li><li> Injectar o corante OI activável (passo 1.1 - 1.2), para medir a actividade de MMP in vivo iv na veia da cauda de ratinhos RA No dia 5 após injecção de GPI-soro e na veia da cauda de ratinhos de controlo. Realizar experiências de imagem óptica 24 h após a injeção da veia da cauda. </li></ol></li><li> Reacção de hipersensibilidade de contacto: <ol><li> Para a sensibilização de ratinhos C57BL / 6, preparar uma solução de TNCB a 5% dissolvida numa mistura 4: 1 de acetona / óleo. </li><li> Anestesiar ratos C57BL / 6 utilizando isoflurano a 1,5% vaporizado em oxigénio a 100% (1,5 L / min). Uma vez que os ratos são anestesiados, colocá-lo em um auto-louco<html> E um cone de nariz (uma seringa de polietileno cortada de 5 mL, ligada ao tubo de isoflurano a 1,5% em volume) e manter a anestesia. Aplique pomada oftálmica veterinária em animais anestesiados para evitar a secura dos olhos durante a anestesia. </li><li> Raspar o abdômen cuidadosamente (2 x 2 cm) usando um pequeno aparador de pêlos de animais. Evite ferir a pele, pois isso pode levar a sinais fluorescentes inespecíficos dentro do animal e pode influenciar os resultados do estudo. </li><li> Aplique 80 μL da solução de TNCB a 5% lentamente na área do abdome raspado, utilizando uma pipeta de 100 μL para sensibilizar o animal. Coloque o mouse suavemente de volta em sua gaiola tendo o cuidado de garantir que os olhos do mouse não entrar em contato com a cama para evitar lesões da córnea e evitar baixas temperaturas corporais durante a fase de recuperação. </li><li> Seis dias após a sensibilização, preparar uma solução de TNCB a 1% (dissolvida numa mistura 9: 1 de acetona / óleo) e aplicar 20 μL na orelha direita utilizando uma pipeta para provocar CHSR aguda e crónica.&quot;&gt; 1 <ol><li> Comece com o primeiro desafio em ambos os lados da orelha direita com 20 μL de solução de TNCB a 1%, utilizando uma pipeta de 100 μL e repita o desafio a cada dois dias até cinco vezes (dia 15 após a sensibilização) para obter CHR ( Figura 1B ) . Medir a espessura da orelha diariamente, usando um dispositivo de medição micrômetro. </li></ol></li><li> Injectar o corante OI activável (uma sonda comercial com excitação a 680 nm) (passo 1.1-1.2) para medir a actividade de MMP in vivo em ratinhos CHR 12 h após a provocação. Realizar experimentos de imagem óptica 24 h após a injeção da veia da cauda ( iv ). </li></ol></li></ol> 3. Preparação de animais para imagens ópticas <ol><li> Mudar o chow do rato (pelo menos 3 dias antes da imagem) para comida baixa ou não fluorescente ( por exemplo , livre de manganês) para evitar a interferência da auto-fluorescência (cerca de 700 nm) com o sinal de fluorescência dos agentes OI utilizados. </li><li> Coloque o animal empara uma caixa de anestesia e anestesiar utilizando 1,5 vol% de isoflurano vaporizado com oxigénio (1,5 L / min) (de oxigénio pode ser substituído por ar, mas deve ser normalizados para cada um experimento). </li><li> Quando o rato é visivelmente anestesiados, colocá-lo em um cone de nariz de auto-fabricados (por construir um corte de 5 mL de uma seringa de polietileno, ligado ao tubo de isoflurano 1,5% vol) e manter a anestesia. </li><li> Raspar o animal cuidadosamente no local alvo (2 cm por 2 cm), utilizando um pequeno aparador de pêlos. Evitar ferir a pele, pois isso pode levar a sinais fluorescentes inespecíficos dentro do animal e pode influenciar os resultados do estudo. NOTA: Os cabelos podem absorver o sinal de fluorescência durante OI (dependente da estirpe de ratinho, mais ou menos absorção é observado), dependendo da região de interesse (ROI). </li><li> Para injecção iv, colocar a cauda do rato em água aquecida, para induzir a vasodilatação, limpar suavemente a pele no local da injecção com álcool, e começar por colocar o cateter emo local distal da cauda. Coloque a &quot;cortar&quot; aresta da agulha em, a um ângulo de 20 ° na veia da cauda e testar a colocação correcta do cateter por re-suspensão da seringa. </li><li> Se o cateter está colocado correctamente, substituir a seringa e injectar a sonda OI (2 nmol). Após a injecção, substituir a seringa e injectar 25 mL de solução salina a 0,9% para totalmente claro o volume morto do tubo de polietileno. NOTA: O tecido tempo de meia-vida do corante usado OI (uma sonda comercial com excitação a 680 nm) para medir a actividade de MMP in vivo é de 72 h. Para garantir uma eliminação completa, a re-injeção do corante não é recomendado mais cedo do que 7 dias após a injecção antes. </li></ol> 4. Imagem Óptico <ol><li> Coloque um plástico preto ou folha de papel na caixa preta do OI-scanner no centro do campo de visão (FOV). </li><li> Defina-se um protocolo de medição e escolher o comprimento de onda direita (excitação: 680 ± 10 nm e eMissão: 700 ± 10 nm) e parâmetros de imagem. NOTA: Em alguns sistemas OI, a configuração para vários corantes de imagem está pré-definida. </li><li> Para escolher o protocolo correto para a imagem de fluorescência, abra o software de criação de imagens (fornecido pelo fabricante) e inicialize o sistema. A maioria das câmeras CCD precisa esfriar a sua temperatura de trabalho, e isso pode levar 10 minutos. Para resultados confiáveis, aguarde até que o sistema esteja pronto. </li><li> Observe o painel de controle de aquisição do sistema de imagem in vivo pop up e cada par de filtros selecionado irá representar uma imagem na seqüência. Neste caso, adquira uma imagem com os pares de filtros para o corante comercial com um comprimento de onda de excitação e emissão de 680 ± 10 nm e 700 ± 10 nm, respectivamente, e inicie a medição (Pressione &quot;Acquire sequence&quot;). Para obter instruções mais detalhadas, consulte o manual do fabricante. </li><li> Rotule adequadamente as imagens e salve as informações na seção &quot;Editar imagemLabels &quot;janela, que irá aparecer após a&quot; seqüência de aquisição &quot;. </li><li> Tome uma varredura basal de cada animal antes da injeção do corante OI, ou use animais de controle ingênuos para diferenciar o sinal de fundo. </li><li> H após a injeção da veia da cauda do corante OI, colocar os animais no centro do FOV, em uma posição para medir o sinal mais alto no sistema OI, e iniciar as medições. NOTA: Importante: A hipotermia pode influenciar significativamente a distribuição de agentes de imagem. Certifique-se que o estágio é aquecido até 37 ° C para evitar a hipotermia do animal. A imagiologia pode ser realizada simultaneamente com animais em grupos de 1 a 5 ratinhos. Escolha o tamanho do FOV dependendo do número de animais a medir ao mesmo tempo. Você pode tirar uma imagem de campo brilhante para verificar se cada mouse está visível. </li></ol> 5. Análise de Dados NOTA: Execute a análise de dados usando o software de imagemProtocolo do fabricante. <ol><li> Para medições de RA, use a unidade calibrada da emissão de fótons como mostrado na Figura 2 , enquanto que a CHSR crônica é representada como a intensidade do sinal em porcentagem (eficiência). </li><li> Para desenhar ROI manualmente, use a placa de ferramentas. Para a análise das imagens RA usar um círculo padronizado, colocado em torno do sinal mais alto em todos os tornozelos e patas de cada animal. Para analisar o CHSR, coloque o ROIs em torno de toda a orelha direita e esquerda de acordo com a imagem do campo brilhante. </li><li> Para medir a emissão de fótons ou os valores de intensidade do sinal no ROI específico, pressione &quot;measure&quot;. O sistema fornecerá valores no ROI desenhado para análise estatística descritiva. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

OI é uma ferramenta muito útil, rápida e barata para imagens moleculares in vivo não invasivas em pesquisas pré-clínicas. Uma força particular de OI é a capacidade de monitorar processos altamente dinâmicos como respostas inflamatórias. Além disso, OI permite que se siga o curso de uma doença por um período de tempo prolongado, variando de dias a semanas. OI tem várias vantagens em relação a outras modalidades de imagem in vivo , tais como a tomografia por emissão de pósitr...

doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide (AR) ou psoríase vulgar são classificadas como reacções de hipersensibilidade do tipo retardado (DTHRs). 1 AR é uma doença auto-imune comum caracterizada por sinovite erosiva e destruição da articulação. 2 articulações artríticas inflamadas demonstrar a infiltração e a proliferação de células inflamatórias, um aumento da expressão de células pró-inflamatórias que conduzem à formação de pannus, cartilagem e osso destruições. 3, 4 A clivagem de moléculas da matriz extracelular, tal como colagio por metaloproteinases de matriz (MMPs), é essencial para a conversão de tecido e a angiogénese e provoca destruição de tecidos. 5, 6 de contato reacções de hipersensibilidade (CHR) são caracterizadas pela agregação de neutrófilos que conduzem a uma explosão oxidativa. 7 Semelhante ao RA, MMPs em CHR são involved na conversão de tecido, a migração celular e a angiogénese, a fim de estabelecer a inflamação crónica. Para investigar a AR, foi usada a isomerase de glucose-6-fosfato (GPI) modelo de ratinho injecção -serum. 8 O soro de ratinhos K / BXN transgénicas contendo anticorpos contra a GPI, foi injectada em ratinhos Balb / c, após o que a inflamação reumática começaram a desenvolver dentro de 24 h com um máximo de tornozelo inchaço no dia 6 após a injecção GPI-soro (ver 1.1). Para analisar CHR crónica, ratinhos C57BL / 6 foram sensibilizados com trinitroclorobenzeno (TNCB) no abdómen. A orelha direita foi desafiada até 5 vezes a partir de 1 semana após a sensibilização (ver também 1,1 e 1,2). Não invasiva pequena OI animal é uma técnica baseada na investigação in vivo de Fluorescente, chemiluminescent- e bioluminescentes-sinais, que são usados principalmente em estudos pré-clínicos. Os dados semi-quantitativa adquiriu dá insights sobre o MolecMecanismos moleculares nos órgãos e tecidos de modelos animais saudáveis ​​e doentes, e permite medições de seguimento longitudinal ( por exemplo, para avaliar os perfis de resposta terapêutica in vivo ). Uma grande vantagem dos estudos longitudinais é a redução do número de animais, uma vez que os mesmos animais podem ser medidos em estudos de acompanhamento em vários pontos de tempo, em vez de usar ratos diferentes por ponto de tempo. A resolução de OI permite imagens funcionais detalhadas de órgãos e estruturas de tecido ainda menores em animais experimentais. O uso de filtros específicos de excitação e emissão com um espectro de transmissão estreito, uma proteção contra a luz dispersa por uma &quot;caixa escura&quot; à prova de luz e uma câmera sensível de acoplamento de carga (CCD), que é resfriada em muitos dispositivos até -70 ° C , Permite medidas altamente específicas e sensíveis de sinais de fluorescência. Utilizando agentes fluorescentes comEspectro de emissão na janela de fluorescência do infravermelho próximo (650 - 950 nm), as relações sinal / ruído podem ser melhoradas significativamente. A janela de fluorescência no infravermelho próximo é caracterizada por uma absorção relativamente baixa do sinal por hemoglobina e água, bem como uma auto-fluorescência de baixo fundo. 9 Isso permite uma profundidade de penetração de até 2 cm no tecido de pequenos animais. As sondas OI podem dirigir-se directamente a um alvo ( por exemplo, por um anticorpo marcado com fluorescï¿½cia) ou podem ser activadas no tecido alvo ( por exemplo, por proteases). As sondas OI activáveis ​​são opticamente silenciosas na sua forma inactivada devido à transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) para uma porção de extinção, que transfere a energia de excitação dentro da molécula para outro domínio. Se o corante é clivado (por uma protease, por exemplo) a energia não é mais transferida dentro da molécula e um sinal fluorescente pode ser detectado por OI. Isto permite a concepção de sondas OI com alta especificidadey para os processos biológicos distintos e excelentes Noise-relações sinal-para-. O protocolo que se segue explica em pormenor a preparação dos animais, as medições OI OI utilizando uma sonda Activatable a imagem de MMP-2, -3, -9 e -13 actividade in vivo e dois modelos experimentais de inflamação (RA, CHR).

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>pomada oftálmica&nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td> seringa de insulina <td>isoflurano</td></tr><tr><td>U40</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0,28 x 0,61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>tubo de polietileno, diâmetro interno 0,28 mm, diâmetro externo 0,61&nbsp; mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Agulhas chanfradas regulares BD, 30 G</td><td>Becton Dickinson & Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>Cânula de injeção de 30 G</td></tr><tr><td>RTA-0011 vaporizador de isoflurano</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC-Artagain</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>papel de desenho</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td>preto carvão</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Sistema de imagem óptica</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 25 G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Cloro-1,3,5-trinitrobenzeno</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>corante de imagem fluorescente</td></tr><tr><td>Oditest&nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>medição mecânica</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL-Oil</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; BALB/C, C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories&nbsp;</td><td>-</td><td>Camundongos usados para experiências</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>Para diluição do soro AR&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta (100 &micro; L)</td> <td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td>Usado para aplicação TNCB&nbsp;</td></tr><tr><td>barbeador&nbsp;</td><td>Wahl&nbsp;</td><td>9962</td><td>Aparador de pêlos de animais</td></tr><tr><td>Living Image&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td></td><td>Software de imagem para medir OI</td></tr></tbody></table>

non-invasive<em&gt; in vivo</em&gt; fluorescência de imagem óptico de inflamatória mmp atividade usando um agente de imaging activatable fluorescente

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

Este trabalho descreve um método não invasivo para a formação de imagens de metaloproteinases de matriz (MMP) por meio de uma sonda fluorescente ativável, através de imagens ópticas de fluorescência in vivo (OI), em dois modelos diferentes de inflamação: uma artrite reumatóide (RA) e um contato Reacção de hipersensibilidade (CHR). A luz com um comprimento de onda na janela do infravermelho próximo (NIR) (650 - 950 nm) permite uma penetração mais profunda do tecido e uma absorção de sinal mínima em comparação com comprimentos de onda inferiores a 650 nm. As principais vantagens da utilização de fluorescência OI é que é barato, rápido e fácil de implementar em diferentes modelos animais. As sondas fluorescentes activáveis ​​são opticamente silenciosas nos seus estados inactivados, mas tornam-se altamente fluorescentes quando activadas por uma protease. As MMPs activadas conduzem à destruição dos tecidos e desempenham um papel importante na progressão da doença em reacções de hipersensibilidade de tipo retardado (DTHRs) tais como RA e CHR. Além disso, as MMPs sãoas proteases essenciais para a cartilagem e osso e são degradação induzida por macrófagos, fibroblastos e condrócitos em resposta a citoquinas pró-inflamatórias. Aqui nós usar uma sonda que é activada pelas MMPs chave como a MMP-2, -3, -9 e -13 e descrever um protocolo de imagiologia para perto OI fluorescência no infravermelho de actividade de MMP na AR e ratinhos de controlo 6 dias após a indução da doença bem como em ratos com aguda (1x desafio) e crônica (5x desafio) CHR na orelha direita em comparação com os ouvidos saudáveis.

Para induzir a artrite reumatóide (RA) em ratinhos BALB / c nativos, os animais foram injectados ip com auto-anticorpos (diluição 1: 1 com 1x PBS) contra GPI no dia 0. A inflamação máxima (inchamento do tornozelo) induzida neste soro GPI O modelo RA está no dia 6 pós-injeção 11 . Por conseguinte, preparou-se 2 nmol do corante OI activável e injectou-se iv na veia da cauda de murganhos artríticos e animais de controlo saudáveis ​​no dia 5. 24 h ap...

Este documento explica a aplicação de imagem fluorescente usando uma sonda de imagiologia óptica activável para visualizar a actividade in vivo de metaloproteinases de matriz chave em dois modelos experimentais diferentes de inflamação.

Non-invasive<em&gt; In Vivo</em&gt; Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

O objetivo geral deste procedimento é utilizar imagem óptica para visualizar uma sonda ativável para avaliação da atividade in vivo de metaloproteinases da matriz essenciais, ou MMPs, em modelos experimentais de inflamação. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre os mecanismos biológicos subjacentes em doenças inflamatórias. As principais vantagens desta técnica são sua rapidez, baixo custo e facilidade de aprendizado.Além disso, está disponível uma grande variedade de sondas para direcionar diferentes processos biológicos. Para a indução da artrite reumatoide, primeiro utilize um micrômetro para medir todos os diâmetros dos tornozelos de cada animal. Em seguida, levante o primeiro camundongo suavemente pela cauda e injete intraperitonealmente 200 microlitros de soro de camundongo KBN diluído contendo anticorpos contra a glicose seis fosfato isomerase ou GPI.Em seguida, coloque o animal de volta em sua gaiola e meça o inchaço do tornozelo diariamente até o sexto dia. Para a sensibilização na hipersensibilidade ao contato, use uma tesoura elétrica para animais de pequeno porte para raspar cuidadosamente uma área de dois por dois centímetros do abdômen de um camundongo anestesiado e utilize uma pipeta de 100 microlitros para aplicar 80 microlitros de uma solução fresca de 5% de TNCB sobre a pele exposta. É muito importante evitar lesar a pele em qualquer momento do procedimento, pois isso pode levar a sinais fluorescentes inespecíficos no animal e afetar os resultados do estudo.Coloque suavemente o animal de volta à sua gaiola, evitando baixas temperaturas corporais durante a fase de recuperação. Seis dias depois, use uma pipeta para aplicar 20 microlitros de solução de 1% TNCB em ambos os lados da orelha direita, seguido pela aplicação de 100 microlitros de 1% TNCB a cada dois dias, por até 10 dias, e medição diária da espessura da orelha. Para medir a atividade de MMP in vivo, primeiro agite suavemente o corante de imagem óptica ativável e carregue uma seringa de insulina de 0,5 mililitro com dois nanomoles do corante por camundongo.Em seguida, prepare outra seringa com uma agulha de 30 graus ligada a um cateter de polietileno e coloque a cauda do primeiro camundongo em água morna. Quando as veias estiverem dilatadas, insira o cateter com a borda cortada da agulha em um ângulo de 20 graus no lado distal da cauda, dentro de uma veia dilatada da cauda, e reconecte a seringa para testar a posição correta do cateter. Se o cateter estiver adequadamente posicionado, substitua a seringa e injete dois nanomolares da sonda.Em seguida, substitua a seringa do probe de imagem óptica por uma seringa contendo solução salina a 0,9% e injete 25 microlitros de salina na veia da cauda para limpar completamente o volume morto do tubo de polietileno. A seguir, ajuste a caixa do scanner de imagem óptica para 37 graus Celsius e coloque até cinco camundongos dentro da caixa do scanner no centro do campo de visão. Vinte e quatro horas após a injeção, abra o software de imagem e inicialize o sistema, permitindo que a câmera CCD esfrie até a temperatura de trabalho.Quando o sistema estiver pronto, ajuste os comprimentos de onda apropriados e os parâmetros de imagem de acordo com a fluorescência da sonda de imagem. O painel de controle de aquisição do sistema de imagem in vivo será exibido. Em seguida, clique em adquirir sequência para iniciar a medição.Para salvar as imagens adquiridas, selecione o local de salvamento desejado. Além disso, mais informações podem ser adicionadas na janela de edição de rótulos de imagem. Aqui, nosso sinal fluorescente claramente aumentado pode ser observado nas patas dianteiras e tornozelos de camundongos com artrite reumatoide no sexto dia após a indução da doença, em comparação com o sinal mínimo observado em animais controle.A análise da biodistribuição da atividade de MMP nos órgãos dos animais experimentais e controles demonstra um sinal fortemente aumentado nos tornozelos e patas dianteiras, exclusivamente nas articulações dos camundongos com artrite reumatoide. Curiosamente, um sinal aumentado de MMP também foi observado em ambos os rins dos camundongos com artrite reumatoide, enquanto o fígado e os intestinos demonstram um sinal robusto de MMP independentemente do status de artrite reumatoide. Durante uma reação de hipersensibilidade crônica ao contato induzida por cinco desafios com TNCB na orelha direita, observa-se uma atividade de MMP altamente aumentada na orelha inflamada direita em comparação com a orelha esquerda, controle saudável.A análise semi-quantitativa da intensidade do sinal em tornozelos ou patas artríticos e saudáveis demonstra uma intensidade de sinal MMP sete vezes maior nos tornozelos artríticos, com uma intensidade de sinal MMP três vezes mais alta detectada nas patas dianteiras em comparação com a dos animais saudáveis. Orelhas com reação de hipersensibilidade cutânea aguda e crônica também exibem um aumento significativo do sinal MMP, mesmo após apenas um desafio, permanecendo elevado até o quinto desafio. Este método pode ser facilmente implementado em diferentes modelos animais experimentais e permite o acompanhamento a longo prazo dos processos biológicos subjacentes e das terapias in vivo.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que cada sonda de imagem óptica possui um procedimento de injeção e tempo de captação diferentes. Portanto, estudos longitudinais devem ser realizados para cada novo corante fluorescente e sonda de imagem óptica. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em até cinco animais em menos de 10 minutos, se executada corretamente.Este método é capaz de fornecer informações sobre os mecanismos de inflamação in vivo, mas também pode ser aplicado para investigar outras doenças, como câncer ou neurodegeneração. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar a imagem óptica in vivo com uma sonda de imagem ativável em modelos de doenças inflamatórias.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a infiltração de macrófagos intestinais em um modelo murino de colite usando tomografia mediada por fluorescência (FMT). Ao induzir colite em um camundongo via sulfato de sódio dextrano (DSS), o animal é injetado com anticorpos que reconhecem o marcador de glicoproteína F4 / 80 em macrófagos infiltrados no cólon. O mouse é então fotografado em um dispositivo FMT, onde os sinais de fluorescência e refletância são reconstruídos em uma imagem...

Usando tomografia mediada por fluorescência para avaliar a inflamação intestinal murina

Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.

No método de imagem in vivo Distinguir inflamação aguda e crônica

Descreve-se um sistema (Maroi) para in vivo quantificação de um marcador fluorescente entregue por saposina C (SAPC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesículas multi-ângulo de rotação de imagem óptica. Utilizando modelos de ratinho de cancro e artrite, é mostrado como a análise da curva de sinal Maroi pode ser utilizado para o mapeamento preciso e caracterização biológica de processos de doença.

In Vivo Imagem Óptico de tumores cerebrais e artrite Usando fluorescente SAPC-DOPS nanovesículas

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

O uso de fluoróforos para imagens in vivo pode ser bastante limitado por opsonização, depuração rápida, baixa sensibilidade de detecção e efeitos citotóxicos no hospedeiro. O encapsulamento de fluoróforos em lipossomas por hidratação e extrusão de filme leva à extinção e proteção de fluorescência, o que permite imagens in vivo com alta sensibilidade de detecção.

Fluorescência-têmpera de um Fluoróforo encapsulado em lipossomas Near-infrared como ferramenta para In Vivo Imageamento óptico

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Mostramos uma técnica para in vivo bioluminescência vivo e no infravermelho próximo de imagem de neurite óptica e encefalite no modelo de encefalomielite autoimune experimental (EAE) para a esclerose múltipla em ratinhos SJL / J.

Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

Sondas de destino-específicos representam uma ferramenta inovadora para a análise de mecanismos moleculares, tais como a expressão da proteína em vários tipos de doença (por exemplo, inflamação, infecção e tumorigênese). Neste estudo, descrevemos uma avaliação tomográfica tridimensional quantitativa da infiltração de macrófagos intestinal em um modelo murino de colite usando tomografia computadorizada mediada por fluorescência de F4/80-específicos.

Tomografia computadorizada mediada por fluorescência para a detecção e quantificação de inflamação Intestinal murino macrófago-relacionados

As alterações morfológicas ocorrem em células de fibroblastos imunes responsivos após a ativação e promovem alterações no recrutamento celular. Utilizando a imagem latente do Photon 2 conjuntamente com uma proteína fibroblástica-específica geneticamente projetada 1 (FSP1)-CRE; tdtomato floxed-parar-floxed (TB/TB) linha do mouse e verde cDNAs Tagged lipopolissacarídeo-FITC, podemos ilustrar a captação altamente específica de lipopolissacaríno em fibroblastos dérmicos e alterações morfológicas in...

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Aprenda imagem óptica fluorescente não invasiva in vivo para visualizar atividade de MMPs em modelos inflamatórios usando sondas ativáveis. Este método rápido e acessível auxilia no estudo de mecanismos biológicos subjacentes.

Non-invasive In Vivo Fluorescência de imagem óptico de Inflamatória MMP Atividade Usando um Agente de Imaging Activatable fluorescente (Vídeo) | JoVE Journal

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