편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 박테리아 세포에서 개별 편모 모터에 부착된 프로브 비드의 회전을 측정하는 것입니다. 우리가 설명할 기술은 운동 반응을 실시간으로 추적하고 허용 가능한 데이터와 허용되지 않는 데이터를 실시간으로 구별할 수 있는 기능을 제공합니다. 이 접근 방식은 기계생물학 분야의 주요 질문에 답하고 분자 운동 행동의 기저에 있는 물리학을 밝히는 데 도움이 됩니다.

우리는 주로 E.coli의 편모 모터를 연구하기 위해 이러한 기술을 사용하지만, 이러한 프로토콜은 다른 종의 편모 박테리아의 모터를 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 결핵에서 끈적끈적한 fliC 대립유전자를 운반하는 원하는 균주의 하룻밤 배양을 성장시킵니다. 다음 날, 10ml의 신선한 결핵을 1:100 희석으로 접종합니다. 600나노미터의 광학 밀도가 0.5가 될 때까지 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 33도에서 배양물을 성장시킵니다.

1500 번 G로 5-7 분 동안 세포를 펠렛화합니다. 그런 다음 펠릿을 10ml의 필터 멸균 운동성 완충액에 격렬하게 재분산시킵니다. 원심분리와 재현탁을 두 번 더 반복합니다.

최종 펠릿을 1mL의 MB로 재분산합니다. 폴리에틸렌 튜브로 연결된 21-23 게이지 어댑터가 있는 두 개의 주사기 사이에서 약 75회 앞뒤로 통과시켜 서스펜션을 전단합니다. 총 전단 시간을 30초에서 45초로 제한합니다. 전단된 세포를 원심분리한 후 펠릿을 100 - 500 마이크로리터의 MB로 재분산시킵니다. 커버 슬립과 현미경 슬라이드 사이에 두 개의 양면 접착 테이프를 끼워 이미징 챔버를 준비합니다.

챔버에 0.01%poly-L-lysine 용액을 추가하고 5분 후에 MB로 표면을 부드럽게 헹굽니다. 40마이크로리터의 셀 현탁액을 챔버에 추가하고 유리 표면에 부착할 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. 챔버의 한쪽 면에 100마이크로리터의 MB를 추가하여 달라붙지 않은 셀을 배출하고 다른 쪽에서는 여과지로 용액을 흡수합니다. 다음으로, 10-15 마이크로 리터의 라텍스 비드를 챔버에 추가합니다.

좋은 대비를 얻을 수 있는 실험을 위해 다양한 크기의 비드를 사용합니다. 비드가 가라앉고 세포에 부착될 수 있도록 충분한 시간을 기다립니다. 100마이크로리터의 MB로 비드를 부드럽게 헹구어 눌어붙지 않은 비드를 제거합니다.

샘플을 현미경 스테이지에 놓고 모터에 부착된 비드가 있는지 표면을 스캔합니다. 어두운 배경에서 밝은 비드를 명확하게 구별할 수 있도록 충분한 대비가 유지되는 한 60X 대물렌즈로 명시야 이미징을 사용할 수 있습니다. 비드를 선택했으면 스테이지를 측면으로 이동하여 미리 결정된 모서리에 비드를 배치합니다.

비드의 회전 방향을 올바르게 알 수 있도록 동일한 모서리에 비드를 배치합니다. 샘플링 주파수를 모터의 회전 주파수의 두 배보다 높게 유지하여 앨리어싱과 관련된 오류를 방지합니다. 이 작업에서는 10배 더 높은 샘플링 주파수를 사용하여 50Hz로 회전하는 모터를 관찰했습니다.

테더링 후 비드가 비드 반경의 1-2배보다 큰 편심으로 흔들리는 것처럼 보이면 셀을 더 많이 전단하는 것이 좋습니다. 여기에 표시된 것은 적절하게 테더링된 비드와 테더링되지 않은 비드 간의 시각적 비교입니다. 500 헤르츠에서 샘플링된 두 광전자 증배관의 출력은 짧은 측정 기간 동안 표시됩니다.

센터링 및 스케일링 후 PMT에서 필터링된 출력은 여기에 표시된 것처럼 회전하는 비드의 원형 궤적을 재구성하는 데 사용되었습니다. 이상적인 비드 궤적은 대략 원형이지만 타원형 궤적은 허용됩니다. 단일 모터의 비드 궤적에서 계산된 각속도는 3초 창에 걸쳐 표시됩니다.

시계 반대 방향과 시계 방향 회전 방향 사이의 모터의 반복적인 전환은 양수 값과 음수 값 사이의 전환으로 표시됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여기에 제시된 광전자 증배관 기반 기술을 사용하여 단일 편모 모터에 테더링된 비드를 높은 정확도로 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아 편모 모터는 수백 헤르츠의 속도로 회전할 수 있기 때문에 고유한 문제를 안고 있습니다.

분자 모터에 연결된 프로브 비드의 고정밀 추적은 kinesins, myosins 및 F1-ATPase를 포함한 여러 유형의 모터의 특성화를 용이하게 했습니다. 비드 테더링 기법을 편모 모터로 확장함으로써 연구원들은 전례 없는 정확도로 모터 역학을 연구할 수 있게 되었습니다. 이 방법의 시각적 시연은 이 기술을 활용하고자 하는 연구자들이 개별 모터에 적절하게 묶인 비드를 찾는 것과 같은 문제를 극복하는 데 도움이 될 것입니다.

여기에서 입증된 방법은 다양한 박테리아 종에서 이러한 나노머신의 적응성에 대한 새로운 통찰력을 개발할 수 있을 것으로 예상됩니다.