Name: Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Öğrenin fare primer hepatosit izolasyonu ve iltihabi yanıt analizi için enzimatik yöntem. ELISA ve gerçek zamanlı PCR ile sitokin ekspresyonunu ve salınımını inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH (R01HL128714 CF) ve (KS F31DK10236101) ve Amerikan Kalp Derneği (CF ve AG) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan protokolleri ve deneysel prosedürler Tıp Miami Miller School Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 1. Hazırlık <ol><li> Ön ısıtma karaciğer perfüzyon medya ve karaciğer 37 ° C&#39;de su banyosunda medyayı sindirmek. </li><li> bir perfüzyon pompası (30 ml / dak) ayarlayın. Dikkatle karaciğer perfüzyon medya ile pompanın boru sistemini önceden doldurmak. sistemdeki herhangi bir hava kabarcıklarını önlemek ve stereotaktik mikroskop hazırlar. </li><li> Üreticinin protokolüne göre kollajen tipi kullanılarak Coat hücre kültürü tabakları. </li></ol> 2. Karaciğer Kurtarma <ol><li> Oksijen / izofluran inhalasyon (izofluran% 4/2 L / dk oksijen) kullanarak donör fare anestezisi. <ol><li> % 2-2.5 izofluran düşürülmesiyle veya ketamin enjekte edilerek anestezi bakımı (100 mg / kg vücut ağırlığı intraperitonal olarak) ve ksilazin (vücut ağırlığı için 10 mg / kg intraperitoneally). Sürekli izofluran anestezi ketamin kan basıncını düşürür ve hepatotoksisite neden olabilir çünkü tercih edilir. </li></ol></li><li> emici ped üzerine anestezi fare yerleştirin. yapışkan bant ile farenin ekstremitelerde düzeltin. </li><li> Tıraş ve fare karın dezenfekte ve keskin / künt uçlu cerrahi makas kullanarak karaciğer kafatası sınırına pubis ventral laparotomi gerçekleştirin. her iki tarafa da karın duvarı, diyaframın kaudal İnsizyon. </li><li> dikkatle sağ tarafa bağırsak hareket ettirerek inferior vena kava (IVC) Açığa. Dikkatle steril pamuk uçlu çubukları ve açılı ucu forseps kullanarak IVC çevresinde yağ dokusu disseke. </li><li> suprahepatik diyafram insizyon ve keskin / sivri uçları ile ince cerrahi makas kullanılarak iki yanal kesiler ile göğüs boşluğu açın. göğüs İVC cerrahi ipek (5/0) ile Arter. </li><li> Dikkatle iğneyi çıkarın, bir korumalı iv kateter kullanarak infrarenal IVC cannulateperfüzyon pompası bağlamak ve karaciğer perfüze başlar. Düzgün gerçekleştirildiği takdirde, karaciğer derhal ağartma ve kabarma başlamalıdır. </li><li> ince cerrahi makas kullanılarak kan ve perfüzyon medyanın uygun drenaj izin damar portal transect. </li><li> Karaciğer perfüzyon ortamının yaklaşık 30 mL &#39;si ile karaciğer serpmek ve CD (30 mL) sindirmek karaciğer geçin. perfüzyon pompası kapatın ve perfüzyon tamamlandıktan sonra kanül kaldırın. </li><li> Yavaşça karaciğer merkez bölgesini ortaya çıkarmak ve karaciğer lobu birbirine bağlayan bağlantı doku bulun. merkezi bağlantı lifleri tut ve dikkatli bir şekilde yerinde karaciğer tutan tüm dokuları incelemek ve yavaşça karaciğer çıkarın. </li><li> Hemen ortamı sindirimi karaciğer 15 mL içeren 50 ml polipropilen konik tüpe karaciğer aktarın. NOT: Bu adım için belirli bir zaman çizgisi vardır. perfüzyon sonra, karaciğer steril bir hücre kültürü kaputu taşıma için özet medyada kalır. Tüm subsequent adımları steril bir ortamda yapılmalıdır. </li></ol> 3. Hücrelerin İzolasyonu ve Tedavi <ol><li> Bir hücre kültürü kaputu içinde, steril bir doku kültürü çanak içine 50 ml polipropilen konik tüp içeren sindirim ortamından karaciğer aktarın. </li><li> Steril forseps kullanarak, yavaşça karaciğerin dört lob gözyaşı. Düzgün gerçekleştirildiği takdirde, sindirim orta nedeniyle karaciğer hepatositleri izole etmek bulanık hale gelmelidir. </li><li> 25 ml steril bir pipet ucu kullanılarak, sindirilmemiş doku partiküllerini ve hücre debrisini uzaklaştırmak için yeni bir 50 ml polipropilen konik tüpe 70 mikron naylon hücre süzgecinden bulanık sindirim orta filtre. </li><li> Tekrar 3.2 ve steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS) ile 3.3 yineleyin. Bu karaciğer herhangi bir kalıntı hepatositler kaldırarak yardımcı olur. </li><li> 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca 50 x g&#39;de santrifüjleyin. 25 ml soğuk 1x hücreleri yeniden askıya hafifçe aşırı hücre artıkları içeren süpernatant aspire veWilliams &#39;Orta E. </li><li> 25 ml steril bir pipet ucu kullanılarak temiz bir süspansiyon elde etmek için 50 ml polipropilen konik tüpe yeni 70 um naylon hücre süzgecinden yeniden süspansiyon filtre. </li><li> Tekrarlayın 3.5 ve daha net bir hücre süspansiyonu elde etmek için soğuk Williams &#39;Orta E 1x kullanarak üç ek yıkar 3.6 adımları. </li><li> Son yıkama aşamasından sonra, aspirat süpernatant aşırı hücre enkaz kaldırmak için. Yeniden askıya ve 50 ml polipropilen konik tüp içine yeni bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden birincil hepatosit çözülme ve kaplama takviyeleri içeren 25 ml ılık Williams&#39;ın &#39;Medya E 1x filtre hücreleri. </li><li> hemasitometre kullanarak 25 ml hücre süspansiyonu içinde hücreleri saymak. yetişkin karaciğer başına 20 milyon hücre - ortalama 15 bekliyoruz. tripan mavisi boyama kullanarak hücre canlılığı belirleyin. </li><li> Bir kollajen kaplı 6-iyi ce birincil hepatosit çözülme ve kaplama takviyeleri içeren 2 ml &#39;Williams Medya E 1x Levha hücrelerill kültür küme (kuyu başına 9 x 10 5 hücre). </li><li> 4 saat sonra, birincil hepatosit bakım takviyeleri içeren Williams&#39;ın &#39;Medya E 1x medyayı değiştirin. </li><li> 24 saat sonra, serum Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) ortamı ile 1 x 6 saat boyunca hücreleri açlıktan öldürmek. </li><li> araç, FGF23 (25 ng / ml), LPS gibi hücrelerin PBS ile tedavi (100 ug / ml) ya da serum barındırmayan ortam içinde IL-6 (50ng / ml) ve 24 saat boyunca inkübe edilir. </li></ol> RNA izolasyonu 4. <ol><li> üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir spin kolon kiti kullanılarak RNA&#39;nın hazırlanması. </li></ol> Ters Transkripsiyon tarafından izole RNA 5. Yaratma cDNA <ol><li> PCR tüpüne izole RNA numunesinin 200 ng ekleyin. </li><li> Aşama 5.1 endonükleaz içermeyen H2O PCR tüpü 14 uL ekleyin. </li><li> Aşama 5.1 PCR tüpü ters transkriptazın 4 ul ekle. </li><li> Karışım homojen hale getirmek için yavaşça içeriğini yeniden askıya; yavaşça santrifüj. </li&gt; <li> bir termalcycler içine karışımı içeren PCR tüp yerleştirin. Çalışma ters transkripsiyon için PCR: daha sonra 25 ° C&#39;de (5 dakika), 42 ° C (30 dk) 1 döngü, 85 ° C (5 dakika) ve 4 ° C&#39;de tutun. Son ürün, arzu edilen cDNA&#39;nın olacaktır. </li></ol> 6. Kantitatif Real-time PCR ile Hücrelerin Analizi (qPCR) <ol><li> 96 oyuklu plaka hazırlanması. <ol><li> 1 uL cDNA, .25 uM ileri primer, .25 uM ters primer, 5 uL SYBR Green, 10 ul toplam hacim 3.5 uL PCR sınıf su: buz üzerinde qPCR reaksiyon tüm bileşenlerini yerleştirin. SYBR Green kullanarak, üç nüsha halinde tüm örnekleri çalıştırmak için ana karışımı hazırlayın. </li><li> master miks tamamlandıktan sonra, girdap homojen hale getirmek için. 96 Wll plakanın her oyuğuna kısım 9 uL qPCR ana karışımı. Sonra, dikkatle her kuyuya cDNA 1 mcL ekleyin. Toplam reaksiyon hacmi 10 uL olacaktır. </li><li> Yükleme tamamlandıktan sonra, optik olarak 96 kuyucuklu bir plaka sızdırmazYapışkan film ve kısa bir süre için santrifüj 96 oyuklu plaka (1 dakika için 50 x g). </li></ol></li><li> Bir Real Time PCR cihazında Run örnekler. Real Time PCR aracı haline mühürlü 96-plaka ve enstrüman üreticisi tavsiyelerine göre çalışacak örnekleri yerleştirin. Standart ve hızlı döngü örnekleri aşağıda yer almaktadır. <ol><li> 60 saniye boyunca, 15 sn için, daha sonra 120 saniye boyunca 94 ° C &#39;de, 60 ° C, 94 ° C 40 döngü, ilk denatürasyon, sonra, isteğe bağlı olarak 4 ° C&#39;de tutun: Standart bisiklet parametreleri, aşağıdaki kullanın. </li><li> Hızlı döngü için parametreler: 5 s, 15 s için 58 ° C, 10 saniye daha sonra 72 ° C&#39;de, daha sonra 30 saniye boyunca 95 ° C 40 döngü 94 ° C sıcaklıkta başlangıç ​​denatürasyon: Aşağıdaki kullanın. </li></ol></li><li> Verileri analiz konusunda rehberlik için cihaz kılavuzuna bakın. </li></ol> ELISA ile hücre üst 7. analizi NOT: Üreticinin protokolüne göre tüm adımları gerçekleştirilir. </p&gt; <ol><li> Örnek hazırlama <ol><li> Ayrı tüpler içine seyrelticinin 398 uL koyun. 398 uL seyreltici tüpüne hücre süpernatanı numunesi Pipet 2 uL. Bu 200 seyreltme kat sağlayacaktır. </li><li> Her bir numune için yineleyin 7.1.1 test edilecek. </li></ol></li><li> prosedür <ol><li> Pipet 100 200 kat seyreltilmiş bir numunenin uL ve 96 oyuklu bir plaka gözlerine standart. </li><li> 150 rpm&#39;de bir mikro-plaka karıştırıcısı üzerinde 45 dakika boyunca 25 ° C&#39;de 96 oyuklu plaka inkübe edin. </li><li> gözenekleri 1x yıkama tampon çözeltisi ile 5 kez yıkayın. Son yıkama tamamlandıktan sonra, emici kağıt ile kalan tüm yıkama solüsyonu çıkarın. </li><li> Her kuyuya HRP konjügatı reaktif 500 ul ekle. </li><li> 7.2.3 - Tekrar 7.2.2 adımları. </li><li> tetrametilbenzidin Pipet 100 uL (TMB), 96 oyuklu plakanın her oyuğuna reajanı. </li><li> Yavaşça mikroplaka üzerinde 20 dakika boyunca 25 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka karıştırın150 rpm&#39;de sarsıcı. doğrudan her kuyuya durdurma çözeltisi 100 mcL ekleyerek reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırın. durdurma çözeltisi ilave edildikten sonra rengi sarı dönmelidir. Bu durak çözüm doğru karışık olduğunu bildirir. </li><li> bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak, ilk 5 dakika içinde 450 nm&#39;de optik yoğunluğu belirlemek. </li></ol></li><li> Sonuçların hesaplanması <ol><li> Her bir örnek, her bir standart için ortalama absorbans değerleri (450) bir tablo hesaplayın. </li><li> Ng standart konsantrasyonuna karşı her bir standart bir 450 ortalaması işaretlenmesiyle bir standart eğri birleştirin / doğrusal grafikte mi. X-ekseni konsantrasyon ve 450 değerleri temsil etmek için y eksenini temsil izin verin. </li><li> Her bir seyreltilmiş örnek 450 ortalama kullanarak, standart eğriden ng / mL, istenen protein konsantrasyonu belirlenir. </li><li> seyreltme facto numune konsantrasyonunu çarpınr. Bu hücre yüzer örnek istenen proteinin gerçek konsantrasyonunu belirlemek için izin verir. </li><li> Bir çizgi grafikte içine örneklerinden inşa tablo çizilir. OD 450 değerleri standart eğrinin dışında kalan, numuneler uygun şekilde seyreltilmiş edilmeli ve yeniden test edilmiştir. </li><li> 500.000 hücrelere sonuçları normalleştirmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Silverstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+chronic+kidney+disease%3A+role+in+the+progression+of+renal+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephro%22%5BJournal%5D)">Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease.</a> Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).</li>
<li>Isakova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+is+elevated+before+parathyroid+hormone+and+phosphate+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).</li>
<li>Faul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+induces+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">FGF23 induces left ventricular hypertrophy.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).</li>
<li>Gutiérrez, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+mortality+among+patients+undergoing+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22N+England+J+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis.</a> N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).</li>
<li>Munoz Mendoza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+Inflammation+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).</li>
<li>Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+Fibroblast+Growth+Factor-23+with+Markers+of+Inflammation%2C+Insulin+Resistance+and+Obesity+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+directly+targets+hepatocytes+to+promote+inflammation+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. , 1-12 (2016).</li>
<li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Moshage, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interleukin-1%2C+interleukin-6+and+its+interrelationship+on+the+synthesis+of+serum+amyloid+A+and+C-reactive+protein+in+primary+cultures+of+adult+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioch+Biophysi+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes.</a> Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).</li>
<li>Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+for+liver+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models for liver toxicity testing.</a> Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).</li>
<li>Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Hepatocytes+by+a+Two-step+Collagenase+Perfusion+Procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Isolation+of+Primary+Human+Hepatocytes+and+Corresponding+Major+Populations+of+Non-parenchymal+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Moshage, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+the+hepatic+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytokines and the hepatic acute phase response.</a> J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).</li>
<li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782563/">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li>
<li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+pathway+in+the+liver%3A+From+physiopathology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li>
<li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShulman%2C+M+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 945, 287-302 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar bildirmek için herhangi bir çıkar çatışması var.

Farelerden alınan birincil hepatositler yalıtma inflamatuar yanıtları ex vivo çalışma için hızlı, ucuz ve güvenilir bir araçtır. Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda, sonuçlar kolaylıkla üretilir ve zamanında ve maliyet-etkin bir şekilde çoğaltılabilir. Aşağıdaki hususlar, dikkatli bir şekilde, başarılı bir izolasyon sağlamak amacıyla değerlendirilmelidir. Cerrahi kesi ve IVC kanülasyon genel anestezi altında ve ötenazi sonra yapılmalıdır. Genç, tecrübesiz araştırma...

Kronik böbrek hastalığı (CKD), akut ve kronik iltihap 1 bir durum olarak tanımlanabilir. KBH olan hastalarda, phosphaturic hormon fibroblast büyüme faktörü 23 (FGF23) serum düzeyleri giderek serum fosfat homeostazisini 2 korumak için yükselir. Artmış serum FGF23 düzeyleri bağımsız hemodiyaliz tedavisi 3, 4 başlıyor hastalarda kardiyovasküler morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. Bundan başka, pek çok klinik çalışmalar, yüksek FGF23 seviyeleri ve C-reaktif protein (CRP), Interlökin-6 (IL-6) ve tümör nekroz faktörü a (TNFa), 5, 6 serum seviyeleri arasında güçlü bir ilişki olduğunu göstermiştir. Ayrıca, deneysel bir çalışmada, son zamanlarda FGF23 doğrudan hepatositler hedef ve artan CRP ve IL-6 p bir inflamatuar yanıta neden olduğunu göstermiştirkaraciğer 7 roduction. Bu nedenle, FGF23 CKD sistemik inflamasyona katkıda bulunan dolaşan bir faktör olarak hareket olabilir. 70 yılların başında, birincil hepatositler izole edildi ve ilk kez 8 okudu. O zamandan beri primer kulturlenmiş hepatik hücreler yoğun, 10 metabolik işlem, hormonal fonksiyon, ilaç metabolizması ve toksisitesinin yanı sıra bağışıklık yanıtlarını ve enflamatuar yanıtları 9 incelemek için kullanılmıştır. Önceki protokoller esas insan karaciğer dokusunda 11, 12 birincil hepatositlerin enzimatik izolasyonuna tarif etmişlerdir. mükemmel bir model olsa da, bu karmaşık karaciğer sinyal mekanizmalarını yanı sıra uyaranların farklı türde üzerine fonksiyonel sonuçlarını nasıl etkilediğini genetik manipülasyon çalışma olanağı dışarıda bırakır. Aşağıda, fare primer hepatositlerinde izolasyonunu tarif. Özellikle, böyle bir lipopolisakarit (LPS), IL-6 ve FGF23 hepatik akut faz tepkisinin birçok aracıların, etkisi, kolay, hızlı ve yeniden üretilebilir bir şekilde 13 analiz edilebilir. Burada, erişkin farelerden hepatositlerin enzimatik izolasyonu için protokol mevcut, ve LPS ve IL-6, hem de böyle bir FGF23 gibi yeni enflamasyon ile ilgili aracıların enflamasyon kurulan indükleyicileri, doğrudan ifadesini ve ifrazatını uyardığını göstermektedir bu tür kültürlenmiş hepatositlerde CRP ve IL-6 gibi enflamatuar sitokinleri,.

<table><tbody><tr><td><güçlü>Sarf Malzemeleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hücreli Süzgeç 70 & m Naylon hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Polipropilen Konik Boru</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 6 inç Pamuk Uçlu Aplikatörler ve nbsp;</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 İnsülin Şırıngası 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü Kabı 100 x 20 mm Stil</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 kuyulu Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Siyah Örgülü Cerrahi İpek (100 yarda)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Perfüzyon Pompası</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Hematitometre Kitleri, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Hemasitometre Kapak Camları, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makaslar - Keskin/Kör</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas-ToughCut Düz</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Forseps</td><td>FST</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Öğrenci Doku Forseps</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit çözeltisi, 2.0</td><td>N Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran, USP 250 mL</td><td>Piramal Sağlık Hizmetleri</td><td>&nbsp; &nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1.000 mg / 10 mL (100 mg / mL)</td> <td>VEDCO</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin 100 mg / mL</td><td>AnaSed Enjeksiyonu</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Willams' Medium E (1x)</td> <td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Karaciğer Perfüzyon Ortamı (1x)</td> <td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Karaciğer Sindirim Ortamı (1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Primer Hepatosit Çözdürme ve Kaplama Takviyeleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Primer Hepatosit Bakım Takviyeleri</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (PBS) pH 7.4</td><td>ThermoFisher bilimsel</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

fare primer hepatosit kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Karaciğer sistemik inflamasyon düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Özellikle kronik böbrek hastalığı, karaciğer Üremik ortamda, oksidatif stres, endotoksemi ve akut faz reaktanları çok sayıda üreterek proinflamatuar sitokinler dolaşımdaki azalmış temizlenmesi cevaben tepki verir. inflamasyon ve hepatositlerin yatan rolü deneysel araçları incelemek için kronik böbrek hastalığı gibi özellikle karmaşık bir ortamda düzenlenmesi ve karaciğer sitokinlerin katkısı sistemik akut faz yanıtı ve uzun bir pro-enflamatuar senaryo, anlamak için çok önemlidir. In vivo enflamasyon karmaşık mekanizmalar okuyan zorlu kaldığından, kaynak-yoğun genellikle ve transgenik hayvanların kullanımını gerektirir, birincil izole hepatositler hepatik akut faz yanıtı içine mekanistik anlayışlar kazanmak için sağlam bir araç sağlar. Bu in vitro tekniği ılımlı maliyetleri özellikleri olduğundan, yüksek yenidenüretilebilirlik ve ortak teknik bilgi, birincil izole hepatositler de kolayca bir tarama yaklaşımı olarak kullanılabilir. Burada, birincil fare hepatositleri izole etmek için bir enzimatik temelli bir yöntem tarif ve biz ELISA ve kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak bu hücrelerin bir inflamatuar yanıtın değerlendirilmesi açıklar.

histoloji Birincil izole edilen ve kültürlenen hücrelerin Örnek ışık mikroskobu görüntüleri Şekil 1A&#39;da gösterilmiştir. İmünositokimyasal analizi izole hepatositler yüksek albümini (kırmızı) hem de fibroblast büyüme faktörü reseptörü 4 (FGFR4) (yeşil) eksprese olduğunu göstermektedir. Çekirdekler 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (mavi) ile boyanır. (Şekil 1B). <p class="jove_step"...

Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Bu prosedürün genel amacı, hepatik akut faz yanıt medyatörlerine karşı CRP ve IL6 gibi enflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu ve sekresyonunu incelemek için fonksiyonel fare hepatositlerini başarıyla izole etmektir. Bu yöntem, hepatosellüler fonksiyonlara ve kronik böbrek hastalığında görülen uzun süreli enflamatuar ortama hepatik sitokinlerin katkısına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; hepatik metabolomik ve enflamasyonun yanı sıra ilaçlara verilen yanıtın basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir analizi için güçlü bir araç sağlamasıdır.Başlamak için, karaciğer perfüzyon ortamını ve karaciğer sindirim ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtmaya tabi tutun. Bir perfüzyon pompasını burada gösterildiği gibi kurun. Ardından, pompanın tüp sistemini dikkatlice önceden doldurmak için karaciğer perfüzyon ortamını kullanın.Sistemde hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterin. Stereotaktik mikroskobu perfüzyon prosedürü için hazırlayın. Ardından, donör fareyi metin protokolüne uygun olarak anesteziye aldıktan sonra, anestezi altındaki hayvanı emici bir pedin üzerine yerleştirin.Farenin ekstremitelerini sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Ardından, farenin abdomenini tıraş edin ve dezenfekte edin. Daha sonra, pubisten karaciğerin kranial sınırına kadar ventral laparotomi gerçekleştirmek için ucu küt ve keskin cerrahi makas kullanın.Karın duvarını, diyaframın kaudal pozisyonunda her iki taraftan kesin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak bağırsakları dikkatlice sağ tarafa çekip vena cava inferior'u veya IVC'yi açığa çıkarın. İnce cerrahi makaslar ve keskin uçlar yardımıyla, suprahepatik diyafram boyunca lateral insizyonlar yapın ve toraks boşluğunu açın.Ardından, torasik IVC'yi bağlamak için 5-0 cerrahi ipek kullanın. Korumalı bir IV kateter ile infrarenal IVC'yi kanüle edin. Perfüzyon pompasını bağlayın ve karaciğer perfüzyonuna başlayın.Doğru şekilde uygulandığında, karaciğer hemen beyazlamaya ve şişmeye başlamalıdır. Ardından, ince cerrahi makaslarla portal veni kesin ve kan ile perfüzyon ortamının uygun şekilde drenajını sağlayın. Karaciğeri yaklaşık 30 mililitre karaciğer perfüzyon ortamı ile perfüze ettikten sonra perfüzyon pompasını durdurun.Karaciğer sindirim ortamına geçin ve pompayı yeniden çalıştırın. Perfüzyon tamamlandığında kanülü çıkarın. Karaciğerin merkez bölgesini nazikçe açığa çıkarın ve karaciğer loblarını birbirine bağlayan bağ dokusunu bulun.Merkezi bağlantı liflerini tutun ve karaciğeri yerinde tutan tüm dokuları dikkatlice diseke edin. Ardından karaciğeri nazikçe çıkarın. Organı hemen, 15 mililitre karaciğer sindirim medyumu içeren 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe aktarın.Hücre kültürü kabininde çalışırken, karaciğeri 50 mililitrelik polipropilen konik tüpten steril bir doku kültürü kabına aktarın. Steril pensler yardımıyla, karaciğerin dört lobunu nazikçe parçalayın. İşlem doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, hepatositlerin karaciğerden izole edilmesi nedeniyle sindirim ortamı bulanıklaşmalıdır.Sindirilmemiş doku parçacıklarını ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için, bulanık sindirim ortamını 25 mililitrelik steril bir pipet ucu kullanarak 70 mikrometrelik naylon hücre süzgeci üzerinden yeni bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe süzün. Birleştirilmiş filtratı dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca 50 ×g hızında santrifüjleyin, ardından fazla hücre kalıntılarını içeren süpernatantı aspire edin ve hücreleri nazikçe yeniden süspande etmek için 25 mililitre soğuk 1X William's Medium E kullanın. Hepatositlerin süzme ve yıkama işlemlerini üç kez tekrarladıktan sonra, fazla hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatantı aspire edin.Hücreleri, primer hepatosit çözme ve ekim takviyeleri içeren 25 mililitre sıcak 1X William's Medium E içinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu yeni bir 70 mikrometre naylon hücre süzgeci aracılığıyla 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Hücreler sayıldıktan sonra, primer hepatosit çözme ve ekim takviyeleri içeren iki mililitre William's Medium E içinde, kolajen kaplı altı kuyucuklu bir hücre kültürü plağına ekimleyin. Hücreleri aç bırakmak için iki kez ortam değişimini takiben; hücreleri serumsuz ortamda araç olarak PBS, 25 nanogram per mililitre FGF23, 100 mikrogram per mililitre LPS veya 50 nanogram per mililitre IL6 ile muamele edin.Kültürleri 24 saat boyunca inkübe edin. Üretici talimatlarına uygun olarak bir spin kolon kiti kullanarak RNA hazırladıktan sonra, izole edilen RNA'dan 200 nanogramı bir PCR tüpüne ekleyin. Ardından tüpe 14 mikrolitre endonükleaz içermeyen su ve dört mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.PCR tüpünü termosikletöre yerleştirin ve cDNA üretmek için aşağıdaki ters transkripsiyon programını çalıştırın. Kantitatif PCR gerçekleştirmek için, aşağıdaki QPCR master mix bileşenlerini buz üzerinde bir tüpte birleştirin. Master mix'i vorteksleyin.Ardından, çözeltiden dokuz mikrolitreyi 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna paylaştırın. Her örnek için üç kuyucuk hazırlayacak şekilde, her kuyucuğa dikkatlice bir mikrolitre cDNA ekleyin. Son olarak, örnekleri gerçek zamanlı PCR cihazında çalıştırın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin.Primer izole edilmiş ve kültüre edilmiş hücrelerin temsili bir ışık mikroskopisi görüntüsü burada gösterilmiştir. İmmünositokimyasal analiz, izole hepatositlerin albumin ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü 4'ü yüksek düzeyde eksprese ettiğini göstermektedir. Bu deneyde, primer izole hepatositler 24 saat boyunca FGF23, LPS veya IL6 ile muamele edilmiş ve CRP ile IL6 mRNA düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir.LPS, IL6 ve FGF23; CRP ve IL6 ekspresyonunu önemli ölçüde artırmıştır. Burada gösterildiği üzere, izole primer hepatositlerden elde edilen hücre kültürü süpernatantları, CRP seviyeleri için ELISA ile analiz edilmiştir. QPCR analizi ile kanıtlandığı üzere, LPS, IL6 ve FGF23 uygulamaları, PBS ile işlem görmüş hücrelerle karşılaştırıldığında, hücre süpernatantlarındaki CRP seviyelerini önemli ölçüde artırmıştır.Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken steril bir ortamın sürdürülmesinin önemli olduğunu hatırlamak gerekir. Primer kültürle çalışıldığı için, optimal sonuçlar elde etmek adına olası kontaminasyon riskini en aza indirmek büyük önem taşır.Bu videoyu izledikten sonra, hepatik sitokinlerin ekspresyonu ve sekresyonu gibi çeşitli hepatosellüler fonksiyonları incelemek amacıyla murine hepatositlerin nasıl başarıyla izole edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Adenovirüs ile temel insan otoantijen ifade farelerin Enfeksiyon, CYP2D6 geniş hepatit, fibrozis ve kuşak tarafından karakterize otoimmün aracılı karaciğer hastalığı kalıcı bir form Tip 2 otoimmün hepatit sonuçları muzdarip hastaların sera tarafından tanınan P450 2D6 (hCYP2D6) sitokrom -belirli bir bağışıklık yanıtı.

CYP2D6 Hayvan Modeli:, Fare Otoimmün Hepatit indükleyin nasıl

Safra akışının bozulması, karakteristik zamana bağlı morfolojik değişiklikler dizisi ile ciddi inflamatuar kolestatik karaciğer hasarına neden olur. Burada, farelerde ortak safra kanalının cerrahi ligasyonu için 21 ila 28 gün sonra güçlü bir fibrotik yanıt indüklemeye izin veren bir protokol sunuyoruz.

Farelerde Safra Kanalı ligasyonu: Obstrüktif Kolestaz tarafından İnflamatuar Karaciğer Hasarı ve Fibrozis indüksiyonu

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Burada bir Kolin eksikliği ve ethionine desteklenmiştir (özgür) diyet yedirerek, kronik karaciğer hasarı farelerde ikna etmek için kullanılan genel yöntem açıklanmaktadır. Sağlık izleme, karaciğer perfüzyon, yalıtım ve koruma göstermektedir. Altı hafta bir zaman ders karaciğer hasarı, pathohistology, fibrozis, enflamatuar ve karaciğer progenitör hücre yanıt hakkında bilgilendirebilir.

Fare Kolin eksikliği, Ethionine desteklenmiştir (özgür) diyet kronik karaciğer yaralanma modeli

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Burada, hepatosellüler kanserin (HCC) tipik bağışıklık özelliklerini özetlemek için karaciğer kanserinin klinik olarak ilgili bir murine modelinin gelişimini açıklıyoruz.

Hepatik İnflamasyon ve Fibrozis Ortamında Ortaya Çıkan Hepatosellüler Kanserin Onkojenik Hepatositkaynaklı Ortotopik Fare Modeli

Burada sunulan değiştirilmiş bir kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak yetişkin fare karaciğerlerinden fare hepatositizolasyon için bir protokoldür. Ayrıca açıklanan bir 3D kollajen sandviç ayarında hepatosituzun kültürü yanı sıra safra kanaliküler oluşumu ve tedaviye yanıt çalışma için sitoskeletal bileşenlerin immünetiketleme.

İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Bu video otoimmün hipofizitis SJL fareler ve histopatoloji ile şiddetini değerlendirmek için nasıl ikna etmek için nasıl gösterir.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Öğrenin fare primer hepatosit izolasyonu ve iltihabi yanıt analizi için enzimatik yöntem. ELISA ve gerçek zamanlı PCR ile sitokin ekspresyonunu ve salınımını inceleyin.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Daha fazla video keşfet