Detektion und Anreicherung von Rare Antigen-spezifische B-Zellen für die Analyse von Phänotypen und Funktion

Das übergeordnete Ziel dieses einfachen, aber effektiven Verfahrens besteht darin, seltene, antigenbindende B-Zellen aus menschlichem peripherem Blut mittels magnetischer Nanopartikel zu isolieren und anzureichern, um sie anschließend phänotypisch und funktionell zu analysieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Immunologie bezüglich des Phänotyps und der Biologie seltener, antigenbindender B-Zellen sowohl vor als auch nach dem Kontakt mit Antigen in vivo zu beantworten. Der entscheidende Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sie Probleme im Zusammenhang mit der Geometrie umgeht, insbesondere dann, wenn man eine Styrolplatte oder eine große Perle verwendet.

Und es beseitigt Probleme im Zusammenhang mit der Durchflussgeschwindigkeit, wenn seltene Zellen aus sehr großen Ausgangszellpopulationen mittels Durchflusszytometrie isoliert werden sollen. Unmittelbar nach dem Sammeln von 30 bis 50 Milliliter Vollblut in heparinisierten Blutentnahmeröhrchen mischen Sie das Blut im Verhältnis 1:1 mit steriler, magnesium- und calciumfreier PBS bei Raumtemperatur. Anschließend schichten Sie die Blutmischung unter Verwendung eines gleichmäßigen, langsamen Pipettierdrucks vorsichtig auf 10 Milliliter einer Dichtegradientenlösung bei Raumtemperatur in einem sterilen 50-Milliliter-Kegelrohr auf.

Trennen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die plasmahaltige, thrombozytenreiche obere Schicht und überführen Sie mit einer sterilen Pipette den mononukleären Zellanteil, den Buffy Coat, in ein neues steriles 50-Milliliter-Röhrchen. Füllen Sie das Röhrchen mit bis zu 50 Milliliter PBS auf, um die mononukleären Zellen durch Zentrifugation zu waschen.

Anschließend das Pellet in 10 Milliliter frischem PBS resuspendieren, zur Zellzählung und die Zellen in frischem PBS auf eine Konzentration von 1×10⁷ Zellen pro Milliliter einstellen und auf Eis halten. Zum Färben der Zellen für die Bindung magnetischer Perlen zunächst 1–2×10⁶ Zellen Aliquote in 5-Milliliter-Polystyrol-Röhrchen überführen, jeweils entsprechend für Fluoreszenz-Kompensation und Fluorescence Minus One-Kontrollen. Danach den restlichen Zellanteil durch Zentrifugation sammeln und das Pellet in steril filtriertem, kaltem FACS-Puffer auf eine Konzentration von 3–6×10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendieren.

Teilen Sie die Zellsuspension gleichmäßig auf vier FACS-Röhrchen auf Eis auf und geben Sie das Blockierreagenz für humanen Fcgamma-Rezeptor zu diesen vier experimentellen Probenfraktionen hinzu. Am Ende der Inkubation zur Blockierung der unspezifischen Bindung fügen Sie die geeigneten fluoreszenzmarkierten Antikörper für die Zelloberflächenmarkierung zu den Zellen in allen vier Probenfraktionen hinzu. Anschließend geben Sie das entsprechende biotinylierte Antigen zu den Fraktionen A und D zu, gefolgt von der Zugabe eines ausreichenden Volumens unmarkierten Antigens zur Fraktion B, sodass der Großteil der Rezeptoren mit einer Affinität von mindestens 1×10⁶ mol blockiert wird.

Alle Proben 30 Minuten auf Eis inkubieren, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation der Fraktion B mit dem entsprechenden biotinylierten Antigen. Am Ende der Inkubationen die Zellen zwei Mal mit je einem Milliliter eiskaltem FACS-Puffer pro 5x10^7 Zellen waschen und die Pellets in einem Milliliter 2 % Formaldehyd pro 5x10^7 Zellen für fünf Minuten im Dunkeln auf Eis resuspendieren.

Nach der Fixierung die Zellen noch zweimal wie eben gezeigt waschen und die Pellets in einem Milliliter frischem, eiskaltem FACS-Puffer pro 5×10⁷ Zellen resuspendieren. Anschließend die Zellen mit ein bis zwei Mikrogramm des geeigneten sekundären, mit Streptavidin konjugierten Antikörpers für 20 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren und die Zellen danach erneut zweimal waschen.

Für die Anreicherung basierend auf magnetischen Nanopartikeln resuspendieren Sie die Zellfraktionen A, B und C in einem Milliliter kaltem Trennpuffer pro 5×10⁷ Zellen und filtrieren die Zellen einzeln durch 40-Mikroliter-Filter, um Klumpen zu entfernen. Fügen Sie anschließend die fluoreszierenden Farbstoff-Nanopartikel in der geeigneten Konzentration 10 Minuten lang im Dunkeln bei vier Grad Celsius unter Rühren hinzu und waschen Sie die Proben zweimal mit je einem Milliliter kaltem Trennpuffer. Resuspendieren Sie die Pellets in einem Milliliter kaltem Trennpuffer pro 5×10⁷ Zellen.

Danach drei magnetische Säulen auf entsprechend großen Magneten mit jeweils drei Milliliter Trennpuffer äquilibrieren, wobei das gesamte Volumen des Trennpuffers durch jede Säule in einen Abfallbehälter laufen lässt. Nun unter jede Säule ein beschriftetes 15-Milliliter-Konischgefäß stellen und die mit magnetischen Partikeln markierten Zellen auf ihre jeweiligen Säulen auftragen. Sobald das gesamte Volumen jeder Zellfraktion durch die jeweilige Säule gelaufen ist, jeweils drei Milliliter frischen, eiskalten Trennpuffer auf die Oberseite jeder Säule geben und die Eluate in den beschrifteten Röhrchen auffangen.

Nachdem die zweite Waschung vollständig durch die Säulen abgelaufen ist, stellen Sie die Röhrchen mit den negativ selektierten Zellen jeder Fraktion auf Eis und übertragen die Säulen in neue 15-Milliliter-Röhrchen für jede Fraktion. Füllen Sie jede Säule mit etwa sechs Milliliter frischem Trennpuffer und durchlaufen Sie den Puffer sofort durch die Säulen, um die magnetisch gebundenen Zellen zu sammeln. Sammeln Sie anschließend sowohl die positiven als auch die negativen Zellfraktionen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets in der geeigneten Lösung für die geplante nachgeschaltete Analyse.

In diesen Diagrammen zeigt die Häufigkeit von Tetanus-Toxoid-reaktiven B-Zellen einer Person, die vor mehr als einem Jahrzehnt zuletzt gegen Tetanus geimpft wurde, dass mit dieser Methode die tetanus-toxoidbindenden Zellen etwa siebenfach angereichert werden können, mit einer Reinheit von etwa 4 %. Durch die Zugabe eines 50fachen Überschusses an nicht markiertem Tetanus-Toxoid zu den Zellen einer Versuchsperson, die etwa drei Jahre vor der Blutentnahme geimpft wurde, und vor der Zugabe des biotinylierten Antigens, wird die Bindung an Tetanus-Toxoid um 83 % verringert, was die Spezifität der Antigenbindung belegt. Wenn das biotinylierte Antigen in der Prozedur weggelassen wird, binden nur noch 0,2 % der B-Zellen, was vermutlich der Bindung einiger nicht-tetanusspezifischer Antigene im Adsorptionsmittel entspricht.

Diese Grafiken zeigen, wie die Häufigkeit von tetanus-Toxoid-spezifischen naiven B-Zellen aus einer Blutprobe, die sieben Tage nach der Auffrischungsimpfung eines gesunden Probanden entnommen wurde, von 84 % auf 64 % nach der Auffrischung sinkt. Gleichzeitig steigt der Anteil der Gedächtnis- und Plasmablast-Populationen von 16 % auf 36 % bzw. von null auf 40 %. Darüber hinaus veranschaulichen repräsentative ELISPOT-Daten aus einer peripheren Blutprobe, die sieben Tage nach der Auffrischung von einem gesunden Probanden gewonnen wurde, die vierfache Anreicherung der Frequenz tetanus-Toxoid-antikörpfbildender Zellen, die in den isolierten tetanus-Toxoid-bindenden B-Zellen beobachtet wurde.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa drei bis vier Stunden mit allen erforderlichen Kontrollen abgeschlossen werden. Die Methode kann mit sekundären Assays kombiniert werden, beispielsweise der Übertragung von Zellen in adoptive Empfänger für nachfolgende Untersuchungen des Zellschicksals und der Zellfunktion. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man seltene, antigenbindende B-Zellen aus menschlichem peripheren Blut unter Verwendung der geeigneten Kontrollen isoliert und anreichert.