L'uso di un'analisi di β-lactamase-based conduttimetriche biosensore per rilevare interazioni biomolecolari

L'obiettivo generale di questo saggio con biosensore condimetrico è rilevare interazioni biomolecolari, utilizzando la tecnologia ibrida della beta-lattamasi. Descriviamo un metodo per rilevare interazioni tra anticorpi e antigeni, impiegando una proteina chimerica di beta-lattamasi. Il principio di questo metodo si basa sul rilevamento del legame mediante la misurazione del rilascio di protoni derivante dall'attività della beta-lattamasi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai tradizionali immunosensori è l'uso di una beta-lattamasi chimerica, che permette di effettuare saggi analitici più economici e rapidi mediante una proteina ibrida per rilevare gli analiti. La procedura sarà illustrata da Mathieu Dondelinger, un ricercatore laureato. Iniziare questa procedura con la preparazione del campione proteico e delle soluzioni, come descritto nel protocollo testuale. Preparare l'elettrodo riutilizzabile immergendo le punte in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione per la preparazione dell'elettrodo, per due minuti, con mescolamento delicato a temperatura ambiente.

Ripetere questo passaggio tre volte. Quindi, risciacquare gli elettrodi immergendo le punte in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di acqua distillata per due minuti con mescolamento delicato a temperatura ambiente. Per rigenerare gli elettrodi, immergere le punte in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione rigenerante tutta la notte a quattro gradi Celsius oppure per un'ora a temperatura ambiente.

Quindi, eseguire tre lavaggi degli elettrodi immergendo le punte in pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetto di soluzione salina tamponata al fosfato. Eseguire ogni lavaggio per due minuti con mescolamento delicato a temperatura ambiente. Rivestire la lisozima da albume d'uovo sulla superficie di polianilina dell'elettrodo depositando una goccia di 15 microlitri di 40 microgrammi per millilitro di HEWL preparata in tampone fosfato sulla superficie dell'elettrodo.

Incubare l'elettrodo per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire tre lavaggi degli elettrodi con tampone fosfato immergendo le parti elettrode dei chip sensori in una pozzetta di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetta di tampone fosfato. Eseguire ogni lavaggio per due minuti con mescolamento delicato a temperatura ambiente.

Saturare gli elettrodi aggiungendo una goccia di 30 microlitri della soluzione bloccante sulla superficie dell'elettrodo. Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare tre volte come in precedenza.

Diluire le soluzioni di BlaP-cAb-Lys3 o BlaP a 20 microgrammi per millilitro nel buffer di legame. Successivamente, applicare una goccia di 15 microlitri di questa soluzione diluita sugli elettrodi. Incubare gli elettrodi per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo la reazione tra antigene e nanocorpo, lavare gli elettrodi tre volte con la soluzione di lavaggio. Successivamente, lavare gli elettrodi del sensore nel buffer di rilevamento immergendoli in una pozzetta di una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri per pozzetta di buffer di rilevamento. Quindi, incubare brevemente per un minuto.

Per il rilevamento, collegare il multimetro digitale al computer. Successivamente, collegare il chip del sensore al multimetro digitale tramite la parte della circuitazione in rame. Avviare la risposta del sensore applicando una goccia di 50 microlitri di soluzione di benzilpenicillina 4 millimolare sugli elettrodi contrassegnati come positivi.

Applicare una goccia di 50 microlitri della soluzione di rilevamento sugli elettrodi etichettati come negativi, da utilizzare come controllo negativo. Monitorare i valori conduttometrici con il multimetro digitale collegato per 30 minuti. Visualizzare i dati in tempo reale direttamente sullo schermo oppure esportare i dati digitali come file di testo.

Questi dati grezzi possono essere riportati in grafico al fine di ottenere un'uscita grafica che rappresenti le misurazioni delle variazioni di conducibilità tra l'elettrodo di riferimento e quello del campione in funzione del tempo. Per costruire la proteina chimerica, la beta-lattamasi di classe A BlaP è stata utilizzata come proteina vettore. Qui, i residui catalitici sono mostrati in rosso.

Il sito di inserzione situato in un loop esposto al solvente è indicato in giallo. Il frammento di anticorpo di cammelloide denominato cAb-Lys3 è stato inserito nel BlaP. La proteina chimera risultante, BlaP-cAb-Lyse3, è in grado di legare l'HEWL mantenendo l'attività beta-lattamasi.

La HEWL è stata immobilizzata su un elettrodo codificato in polianilina prima del caricamento di BlaP-cAb-Lys3. Il rilascio di protoni durante l'idrolisi del benzilpenicillina da parte della proteina chimera immobilizzata induce variazioni di conducibilità che possono essere interpretate dall'utente. I sensori contengono otto chip organizzati in quattro coppie.

Ogni chip comprende tre elettrodi: un elettrodo di lavoro rivestito con polianilina, un elettrodo di riferimento e un elettrodo contatore. Per ogni coppia, il chip etichettato come negativo corrisponde a un controllo negativo, mentre il chip etichettato come positivo corrisponde al campione testato. Vengono mostrate qui misurazioni di conduttanza che evidenziano l'interazione specifica tra BlaP-cAb-Lys3 e HEWL.

Le variazioni di conducibilità derivano dal rilascio di protoni indotto dall'idrolisi dell'antibiotico da parte della beta-lattamasi chimerica immobilizzata. Nessun legame è stato rilevato per il controllo negativo, la beta-lattamasi nativa BlaP. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in mezza giornata se effettuata correttamente e se le condizioni sperimentali sono ottimizzate.

Generalmente, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché l'inserimento di un frammento anticorpale in BlaP è complesso. Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la qualità dei dati ottenuti dipenderà dalla funzionalità della beta-lattamasi chimerica. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi che consentono la quantificazione dell'interazione rilevata, al fine di determinare la costante di associazione all'equilibrio di tale interazione.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei biosensori immunitari per esplorare le interazioni molecolari in vari campioni, che vanno da organismi viventi a diversi ambienti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono al rilevamento di numerose biomolecole, poiché la tecnologia della beta-lattamasi chimerica è uno strumento versatile per funzionalizzare qualsiasi anticorpo o frammento proteico nelle applicazioni principali. Pertanto, potrebbe essere utilizzata per sviluppare strumenti diagnostici economici e rapidi in numerosi settori, come la salute umana e animale.