Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים

המטרה הכוללת של שיטה זו היא להשתמש בפרוסות ריאה חתוכות במדויק, או PCLS, כדי לדמיין את הלוקליזציה והסחר של סוגי תאים חיסוניים שונים בריאה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון דפוסי לוקליזציה ונדידה של תאי חיסון בריאה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין מספר אינטראקציות ברקמת ex vivo חיה השומרת על הארכיטקטורה התלת מימדית של הריאה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי לוקליזציה וסחר של תאי חיסון במהלך דלקת, ניתן להשתמש בה גם כדי לדמיין התכווצות של דרכי הנשימה ורקמת השריר החלק. כדי לקצור את רקמת הריאה, השתמש תחילה במספריים כדי לפתוח את העור והצפק מאמצע הבטן עד ללסת של עכבר בן שישה עד 12 שבועות, והעביר את המעיים לצד חלל הבטן. חתכו את הווריד הנבוב התחתון כדי לנקז את הדם מהריאות, והשתמשו בקצה החד של המספריים כדי לנקב את הסרעפת כדי לאפשר הרחבה של כלוב הצלעות.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למשוך ידנית את בלוטות הרוק ורקמות אחרות הרחק מקנה הנשימה, והשתמש במלקחיים עדינים כדי לבצע חתך בקנה הנשימה בצד הקדמי של רצועת הסחוס העבה ביותר, רק גדול מספיק כדי לאפשר למחט בגודל 20 לחדור. כעת החלק מחט בגודל 1.5 אינץ' 20 על קטע של צינורות פוליאתילן, וחתוך את הצינור בזווית של כ-45 מעלות. חבר את המחט למזרק מיליליטר אחד, ושאב 0.8 מיליליטר של 40 מעלות צלזיוס 2% נקודת התכה נמוכה לתוך המזרק.

לאחר שכל האגרוז נטען, הכנס את הקצה המשופע של הצינור לתוך החתך, והזריק לאט את האגרוז לריאות. מבלי להזיז את המחט או המזרק, הדביקו את המזרק לבסיס הפוליסטירן כדי להדק את המחט בתוך קנה הנשימה, והניחו את החיה באחסון של 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפחות. לאחר שהאגרוז התמצק, השתמש במספריים כדי לכרות בזהירות את הריאות, והניח אותן בצלחת של שלושה סנטימטרים המכילה PBS קר כקרח.

לאחר מכן סובב את האונה לחיתוך רקמות כך שהחלק הפנימי של הריאה שמתחבר לקנה הנשימה יפנה כלפי מטה. כדי לפרוס את רקמת הריאה, הניחו תחילה טיפה קטנה של דבק-על ג'ל All Purpose No Run על בוכנת מזרק מתכת, ופזרו את הדבק בתנועה סיבובית. לאחר מריחת כל הדבק, השתמש במלקחיים כדי לתפוס מיד אך בעדינות את צד קנה הנשימה של האונה שנכרתה כלפי מטה, וטפח את האונה על טישו כדי להסיר את עודפי הנוזל.

הניחו בזהירות את האונה המיובשת על גבי הבוכנה, וחתכו כל רקמה נוספת המשתרעת מעבר לקצה הבוכנה. הזיזו את הבוכנה כלפי מטה כך שדפנות מזרק המתכת ינועו למעלה ומעל הרקמה, ויוצרים באר עם הריאה בתחתית פיר המזרק שעומקה אינו עולה על כמה סנטימטרים. הדביקו את הדבק סביב תחתית המזרק כדי להחזיק את הבוכנה במקומה.

לאחר מכן שפכו בזהירות 40 מעלות צלזיוס 2% נמס נמוך לתוך המזרק כך שהוא פשוט יכסה את החלק העליון של האונה, והקיפו את מזרק המתכת בבלוק קירור קר כקרח. לאחר דקה עד שתיים, טען את מזרק הדגימה לתוך הפורס האוטומטי, ויישר את הלהב הטרי. לאחר מכן, מלאו את מיכל החיץ ב-PBS קר כקרח.

יישר את כונן מנוע הצעד עם מזרק הדגימה, והסר את הסרט. סובב את המתג למצב קדימה מהירה, עד שכונן מנוע הצעד פשוט נוגע בחלק האחורי של הבוכנה. הגדר את הגדרות עובי הרקמה, פרוסה בודדת רציפה, תנודה ומהירות בפורס.

לאחר מכן לחץ על התחל והשתמש במרית דקה כדי לאסוף כל PCLS כשהוא נופל למיכל החיץ, והניח את הפרוסות לבארות בודדות של צלחת 24 בארות המכילה PBS קר כקרח. להדמיית PCLS סטטית, העבירו את דגימות הריאה המכילות את אזור העניין האנטומי לצלחות בודדות של שלושה סנטימטרים המכילות מיליליטר אחד של קוקטייל הנוגדנים המתאים המעניין. לאחר 30 עד 60 דקות על קרח עם נדנדה ומוגן מפני אור, יש לשטוף את הפרוסות פעמיים עם מיליליטר PBS קר כקרח.

לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר PBS לכלי זכוכית עגול אחד חדש באורך שלושה סנטימטרים לכל דגימה, והעבירו במהירות את הפרוסות לכל טיפה, תוך מניפולציה עדינה של חתיכות הרקמה כך שהן נמרחות שטוחות. לאחר מכן שאפו את ה-PBS בעזרת פיפטה, והניחו טיפה של מדיום הרכבה בטמפרטורת החדר על המגלשה, ואחריה החלקת כיסוי זכוכית. כדי לדמות את הרקמה, הנח את המנה על שלב מיקרוסקופ קונפוקלי תחת מטרה של פי 20, והשתמש בכלי האריחים כדי לאתר ולסמן את קצוות הרקמה בהגדרת הגוף הקמור כדי להפחית את זמן סריקת האריחים.

לאחר מכן הגדר את טווח ה-z-stack, וודא שהטווחים שנקבעו מתאימים במספר אזורים של הפרוסה, במיוחד לאורך הקצוות. להדמיית תאים חיים, לאחר 30 דקות של דגירה בקוקטייל הנוגדנים המעניין, יש לשטוף את הפרוסות פעמיים במיליליטר לייבוביץ 10 קר. לאחר מכן, הוסף 50 מיקרוליטר של לייבוביץ 10 טרי לחריץ אחד של זכוכית כיסוי תא לכל דגימה, ולאחר מכן העברה מיידית של כל PCLS למדיום, תוך מניפולציה עדינה של הרקמות עד שהן מתפשטות שטוחות.

לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי לשאוב את המדיום מכל תא ולעגן כל PCLS במשקל פלטינה. יש להניח בזהירות מטריצה חוץ-תאית קרה כקרח שהוכנה על כל PCLS, תוך הקפדה שהג'ל יונח על גבי פרוסות הריאה, ושהפרוסות לא יצופו על גבי הג'ל. לאחר חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס, העבירו את המגלשה לתא מיקרוסקופ קונפוקלי מחומם מראש המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס תחת מטרה של פי 20.

לאחר מכן, הגדר את טווחי ה-z-stack והאריחים על סמך המרווח הרצוי בין המסגרות, באמצעות כלי האריחים כדי לציין את אזור העניין ברקמה, והגדרת הרשת הממורכזת כדי למרכז את הדגימה בשדה הראייה. תאים דנדריטיים קונבנציונליים גבוהים CD11b מתמקמים בפרנכימת הריאות, בעוד שתאים דנדריטיים קונבנציונליים חיוביים ל-CD103 שוכנים בעיקר סביב דרכי הנשימה והאזור התת-פלאורלי. צביעה משותפת עבור CD88 ו-CD172a, מאפשרת הבחנה בין מקרופאגים אלבאולרים שליליים CD172a, CD88 חיוביים, לבין CD172a חיובי, מקרופאגים אינטרסטיציאליים חיוביים CD88, שהאחרונים ממוקמים באופן מועדף בפרנכימה, ולא באזור התת-אפיתליאלי.

תיוג משותף ל-CD90.2, סמן ידוע של תאי T, וחלבון הפלואורסצנטי TdTomato, טרנסגן תחת בקרת שעתוק של גורם שעתוק ראשי הדרוש ללימפגיוגנזה, מקל על זיהוי מבנים לימפתיים בריאה. תאים דנדריטיים קונבנציונליים חיוביים ל-CD103 נמצאים במספר אזורים אנטומיים, כולל אפיתל דרכי הנשימה CD324, הלימפה והאזור התת-פלאורלי. ניתן לתעד תנועת תאים ואינטראקציות בין תאים באמצעות הדמיית תאים חיים כפי שהודגם זה עתה.

לדוגמה, בניסוי המייצג, 16 שעות לאחר התקנת ביציות דרך הפה, ניתן לראות בבירור תאים דנדריטיים חיוביים CD103 מקיימים אינטראקציה עם תאי T ספציפיים לביציות שהועברו באימוץ במשך תקופה של ארבע שעות. לאחר השליטה, ניתן להשלים את הכנת הרקמות וטכניקות החיתוך תוך שעתיים וחצי אם הן מבוצעות כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשיג ניפוח ריאות אגרוז טוב, ולאחר מכן לשמור על פרוסות הריאה העדינות שטוחות ככל האפשר להדמיה.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו טיפול ב-PCLS עם אצטילכולין או מתכולין, כדי לענות על שאלות נוספות לגבי איתות סידן והתכווצות דרכי הנשימה במצבי מחלה שונים. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור פרוסות ריאה חתוכות מדויקות להמחשת הלוקליזציה, הסחר והאינטראקציות של תאי חיסון בריאה.