Name: ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: למדו שיטה לניתוח ספציפיות נוגדנים היסטון באמצעות מערכי פפטידים. הטכניקה מספקת פרופילים מדויקים לבקרת איכות בביוכימיה כרומטין ומחקר אפיגנטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מכון המחקר ואן אנדל ומענק מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות (CA181343) כדי SBR

למחברים אין מה לחשוף.

אמינות נוגדנים ביישומים רפואיים ביו-רפואיים היא בעלת חשיבות עליונה 46 , 47 . זה נכון במיוחד בביוכימיה הכרומטין בהתחשב בעמדה של נוגדנים כמו כלי מפתח עבור רוב הטכניקות שפותחו כדי לאפיין את שפע והפצה של PTMs היסטון. הפרוטוקול המוצג כאן פרטים צינור אופטימיזציה עבור עיצוב, ייצור, ושימוש microarrays פפטיד לנתח היסטון PTM נוגדנים היסטון. צינור זה שימש למסך מספר רב של נוגדנים PTM היסטון זמין מסחרית בשימוש נרחב, והנתונים שנוצרו בני...

הדנ&quot;א הגנומי הוא ארוז באלגנטיות בתוך גרעין התא האוקריוטים עם חלבונים היסטון ליצירת הכרומטין. יחידת המשנה של הכרומטין היא הנוקלאוזום, המורכב מ -147 זוגות בסיס של דנ&quot;א עטופים סביב ליבה אוקטמית של חלבונים היסטוניים - H2A, H2B, H3 ו- H4 1 . הכרומטין מאורגן באופן כללי לתוך euchromatin ארוז רופף ותחומים heterochromatin ארוז בחוזקה. מידת הדחיסה הכרומטין מסדירה את המידה שבה machineries חלבון יכול לגשת DNA הבסיסית לבצע תהליכים בסיסיים DNA תבניות כמו שכפול, שעתוק, ותיקון. רגולטורים עיקריים של נגישות הגנום בהקשר של הכרומטין הם PTM על זנב בלתי מובנה ותחומי הליבה של חלבונים היסטון 2 , 3 . Histone PTMs לתפקד ישירות על ידי השפעה על המבנה של הכרומטין 4 בעקיפין througH גיוס של חלבונים הקורא מתחמי macromolecular הקשורים להם כירומטין שיפוץ, פעילויות אנזימטיות, פיגומים 5 . מחקרים של פונקציה PTM היסטון במהלך שני העשורים האחרונים להצביע על הסימנים האלה לשחק תפקידים מרכזיים בוויסות גורל התא, התפתחות אורגניזמים, ואת תחילת המחלה / התקדמות. מונעת על ידי ההתקדמות של הטכנולוגיה מבוסס proteomic מבוססי ספקטרומטריית מסה, יותר מ -20 PTMs היסטון ייחודי על יותר מ 80 שאריות היסטון שונים התגלו 6 . יש לציין כי שינויים אלה מתרחשים לעיתים קרובות בשילובים, ועולים בקנה אחד עם ההשערה &quot;קוד היסטון&quot;, מחקרים רבים מציעים כי חלבונים הקורא ממוקדות אזורים נפרדים של הכרומטין באמצעות הכרה של שילובים ספציפיים של PTMs היסטון 7 , 8 , 9 . אתגר מפתח להתקדם יהיה להקצות פונקציות לגררשימה של htone PTMs ולקבוע כיצד שילובים ספציפיים של PTMs היסטון לתזמר את הפונקציות דינמי הקשורים הכרומטין. נוגדנים הם ריאגנטים lynchpin עבור זיהוי של PTMs היסטון. ככזה, יותר מ -1,000 נוגדנים ספציפיים PTM ספציפי היסטון פותחו מסחרית לשימוש במחקר ביוכימיה הכרומטין. עם התפתחות מהירה של התפוקה גבוהה דנ&quot;א טכנולוגיית רצף, ריאגנטים אלה נמצאים בשימוש נרחב על ידי חוקרים בודדים בקנה מידה גדול epigenomics &quot;מפת הדרכים&quot; יוזמות ( למשל , ENCODE ו BLUEPRINT) ב שבב- seq (כרום immunoprecipitation הכרומטין עם הדור הבא רצף ) צינורות ליצור ברזולוציה גבוהה מפות מרחביות של היסטון PTM היסטון גנום רחב 10 , 11 . עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הספציפיות של נוגדנים PTM היסטון יכול להיות משתנה מאוד וכי ריאגנטים אלה התערוכה unf<html> תכונות אבורייביות כגון הכרה ב- epitope מחוץ להשפעה, השפעה חיובית ושלילית חזקה על-ידי PTM שכנות וקושי בהבחנה של סדר השינוי על שאריות מסוימת ( לדוגמה , מונו-די- או טרי-מתילייזין) 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . לכן, בקרת איכות קפדנית של ריאגנטים נוגדנים ספציפיים היסטון PTM יש צורך לפרש במדויק נתונים שנוצרו עם אלה ריאגנטים יקר. טכנולוגיית Microarray מאפשרת חקירה סימולטנית של אלפי אינטראקציות macromolecular בתפוקה גבוהה, לשחזור, ואת פורמט ממוזער. מסיבה זו, מגוון של פלטפורמות microarray נוצרו לנתח חלבון DNA 19 ,&quot;20, חלבון 21 חלבון, אינטראקציות חלבונים פפטיד 22. אכן, microstrays פפטיד היסטון צמחו כפלטפורמה גילוי אינפורמטיבי עבור מחקר ביוכימיה הכרומטין, המאפשר פרופיל התפוקה גבוהה של סופרים, מחקים, ו הקוראים של PTMs היסטון 15 , 23 , 24 , וכן לניתוח של נוגדנים הנוגדן היסטון 17 , 25. מעבר ליישום שלהם במחקר הכרומטין ו epigenetics, מערכי פפטיד היסטון יש פוטנציאל השירות כמו אבחון / בדיקה פרוגנוסטית זאבת מערכתית אריתמטוס ומחלות אוטואימוניות אחרות שבו אנטי- נוגדנים עצמיים הכרומטין נוצרים 26 , 27 . כאן, אנו מתארים צינור משולב שפיתחנו עבור עיצוב, בודה, queRyan histone microptrays פפטיד כדי ליצור פרופילים ספציפיות עבור נוגדנים לזהות histones ו PTM שלהם. צינור הוא הקל על ידי ArrayNinja, קוד פתוח, יישום תוכנה אינטראקטיבית כי פיתחנו לאחרונה, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של ניסויים microarray 28 . ArrayNinja עובד הכי טוב ב- Google Chrome. בקצרה, מדפסת microarray קשר רובוטית משמש להפקיד ספריה של פפטידים היסטון ביוטין מצומדות במיקומים מוגדרים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית streptavidin מצופה. מערכים לאחר מכן ניתן להשתמש בפורמט assay תחרותי במקביל לחקור אינטראקציות נוגדן-epitope ( איור 1 ). הספריה פפטיד מורכב מאות פפטידים סינתטיים ייחודי מחסה PTMs (ליזין acetylation, ליזין / מתילציה ארגינין, ו serine / threonine זרחון) לבד בשילובים רלוונטיים נגזר בעיקר מן הנתונים datasets proteomics. שיטות סינתזה פפטיד ואימות<html> מפורטים במקום אחר 23. נתונים שנוצרו על ידי המתמשך שלנו histone PTM נוגדנים בדיקות הסינון באמצעות פלטפורמת מערך זה מאוחסנים על משאב אינטרנט ציבורי, היסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים (www.histoneantibodies.com). יש לציין, כי microarrays היסטון פפטיד מפוברק עם וריאציות של פרוטוקול זה שימשו גם בהרחבה כדי לאפיין את פעילותם של תחומים הקורא PTM היסטון 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 ולאחרונה פרופיל היסטון PTM סופר ומחק פעילויות 24 . /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: תיאור קריקטורה של נוהל שלב של הקרנת נוגדנים על micropray פפטיד היסטון. פפטידים היסטון Biotinylated מחסה שינויים שלאחר טרנסלציה מוגדרים (עיגולים אדומים וכחולים) מודפסים בשיתוף עם biotin-fluorescein על זכוכית מצופה streptavidin. אינטראקציות חיוביות הם דמיינו כמו פלואורסצנטי אדום. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>מערך מאגר הדפסהIt</td><td></td><td>PPB</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Omnipure</td><td>2390</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית מצופה סטרפטווידין</td><td>גריינר ביו-אחד</td><td>439003-25</td><td></td></tr><tr><td>פוליפרופילן 384 צלחת באר</td><td>גריינר ביו-אחד 784201</td><td></td><td></td>ביוטין-פלואורסצאין</tr><tr><td></td><td>סיגמא</td><td>53608</td><td></td></tr><tr><td>מדפסת מיקרו-מערך מגע</td><td>Aushon</td><td>2470</td><td>Aushon 2470 מדפסת Microarray</td></tr><tr><td>מגע מדפסת מיקרו-מערך</td><td>מכונות Gene</td><td>Machines OmniGrid 100</td><td>OmniGrid Microarray מדפסת</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>מערך מאגר חוסם</td><td>SBB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עט שעווה הידרופובי</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>ImmEdge מחסום הידרופובי PAP עט</td></tr><tr><td>סיליקון אטם</td><td>גרייס ביו-מעבדות</td><td>622511</td><td></td></tr><tr><td>הכלאה כלי</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td>או כלי דומה</td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי</td><td>Life Technologies</td><td>A-21244</td><td>Alexa Fluor 647 (נגד ארנב)</td></tr> <tr><td>נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי</td><td>Life Technologies</td><td>A-21235</td><td>Alexa Fluor 647 (נגד עכברים)</td></tr> <tr><td>שעווה Imprinter</td><td>ArrayIt</td><td>MSI48</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Omnipure</td><td>9490</td><td></td></tr><tr><td>Microarray Scanner</td><td>Innopsys</td><td>InnoScan 1100AL</td><td>או שווה ערך microarray סורק</td></tr><tr><td>EipTitan היסטון פפטיד Microarray</td><td>Epicypher</td><td>112001</td><td></td></tr><tr><td>AbSurance Pro היסטון פפטיד Microarray</td><td>Millipore</td><td>16668</td><td></td></tr><tr><td>MODified היסטון מערך פפטיד</td><td>מוטיב פעיל</td><td>13001</td><td></td></tr><tr><td>קוד היסטון מיקרו-מערכי פפטיד</td><td>JPT</td><td>His_MA_01</td><td></td></tr><tr><td>שעווה</td><td>רויאל אלון</td><td>GulfWax</td><td>למדפיס שעווה</td></tr><tr><td>תא היברידיזציה מיקרו-מערך לח VWR</td><td></td><td>97000-284</td><td></td></tr><tr><td>תא כביסה שקופיות מיקרוסקופ תפוקה גבוהה</td><td>ArrayIt</td><td>HTW</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ צנטריפוגת שקופיות</td><td>VWR</td><td>93000-204</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן 1</td><td>Abcam</td><td>8898</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן 2</td><td>Millipore</td><td>07-473</td><td></td></tr><tr><td>פפטיד היסטון ביוטיניל</td><td>EpiCypher</td><td>12-0001</td><td>פפטיד לדוגמה. פפטידים דומים עם שינויים שונים זמינים ממספר מקורות מסחריים.</td></tr><tr><td>ImageMagick</td><td></td><td></td><td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td></tr><tr><td>ArrayNinja</td><td></td><td></td><td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td></tr></tbody></table>

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם microprays פפטיד

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

לאחר שינויים טרנסלציוניים (PTM) על חלבונים היסטון נחקרים באופן נרחב עבור תפקידים שלהם ויסות מבנה הכרומטין ביטוי גנים. ייצור המוני והפצה של נוגדנים ספציפיים PTMs היסטון יש להקל מאוד מחקר על סימנים אלה. כמו נוגדנים PTM היסטון הם ריאגנטים מפתח עבור יישומים ביוכימיה רבים הכרומטין, ניתוח קפדני של נוגדנים הספציפיות נחוץ לפרש נתונים מדויק והמשך ההתקדמות בתחום. פרוטוקול זה מתאר צינור משולב עבור ייצור, ייצור ושימוש של microprays פפטיד עבור אפיון הספציפיות של נוגדנים היסטון. עיצוב וניתוח היבטים של הליך זה הם הקלו על ידי ArrayNinja, קוד פתוח וחבילת תוכנה אינטראקטיבית פיתחנו לאחרונה כדי לייעל את ההתאמה האישית של פורמטים להדפיס microarray. צינור זה שימש למסך מספר רב של antibodie PTM זמין מסחרית בשימוש נרחבS, ונתונים שנוצרו בניסויים אלה זמינים באופן חופשי דרך האינטרנט והרחבת ההיסטון נוגדנים היסטון מסד נתונים. מעבר היסטונים, המתודולוגיה הכללית המתוארת כאן ניתן ליישם באופן רחב לניתוח של נוגדנים ספציפיים PTM.

פרוטוקול זה שימש לעיצוב לפברק פלטפורמת microarray פפטיד לניתוח של סגוליות נוגדנים PTM היסטון. מערך שאילתות ספריה של יותר מ -300 תכונות פפטיד ייחודי (20 - 40 שאריות באורך) המייצג רבים של שילובים ידוע של PTMs למצוא על הליבה חלבונים היסטון חלופה 38 . צינור זה כבר סוס עבודה להקרנה של נוגדנים רבים PTM היסטון בשימוש נרחב מסחרית זמין, ומאגרי נתונים מלאים זמינים על מסד הנתונים נוגדנים היסטון Histone (www.histoneantibodies.com). <sup...

כתב היד מתאר שיטות להחלת הטכנולוגיה microarray פפטיד פרופיל פרופיליות של נוגדנים כי לזהות היסטונים ושינויים שלאחר translational שלהם.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

מטרת סרטון זה היא לתאר תהליך עבודה (pipeline) משולב לתכנון, לייצור ולשימוש במערכי מיקרו-מערכים של פפטידים (peptide microarrays) לצורך אפיון הספציפיות של נוגדנים להיסטונים. נוגדנים המזהים היסטונים ואת המגוון הרחב של המודיפיקציות הפוסט-טרנסלציונליות שלהם הם ריאגנטים מרכזיים במחקר ביוכימיה של כרומטין. אנו מסתמכים על כלים אלו כדי להעמיק את הבנתנו בתפקוד של מודיפיקציות היסטונים.מחקרים עדכניים חושפים חוסר עקביות בהתנהגות של נוגדנים להיסטונים. מכיוון שבחירת הנוגדן היא האלמנט הקריטי ביותר בניסויי אפגנטיקה, נדרשים מדדי בקרת איכות קפדניים ומקיפים עבור ריאגנטים אלו. כאן, אנו מציגים תהליך עבודה (pipeline) אינטגרטיבי שפיתחנו לתכנון, ייצור וניתוח של מיקרו-מערכים של פפטידים (peptide microarrays), במטרה להפיק פרופילי ספציפיות עבור נוגדנים המזהים היסטונים ומודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות שלהם.תהליך העבודה מיושם באמצעות Array Ninja, אפליקציית תוכנה אינטראקטיבית בקוד פתוח שפיתחנו, המשלבת את שלבי התכנון והניתוח של ניסויי מיקרומערכים (microarrays). כדי להתחיל בתכנון שקופית המערך, תחת כותרת תכנון פריסת שקופית (plan a slide layout), בחרו את מדפסת המיקרומערכים שבה תשתמשו. לאחר מכן, הקלידו empty בשדה טעינת פלטה (load plate) ולחצו על enter.הגדירו את קוטר הנקודה ל-275 micrometers ואת המרווח בין הנקודות ל-100

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול משופר עבור microarray תפוקה גבוהה מרובב נוגדנים עם שיטת הזיהוי lectin כי ניתן להשתמש פרופיל glycosylation של חלבונים מסוימים. פרוטוקול זה כולל ריאגנטים אמינים חדשים מפחית באופן משמעותי את הזמן, עלויות, ציוד מעבדה דרישות לעומת בהליך הקודם.

נוגדן microarray כימי חסומים פרופיל תפוקה גבוהה מרובב של Glycosylation חלבון מסוים בדגימות מורכבות

סרטון זה מדגים טכניקה המיישמת טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי כדי לאפיין את הספציפיות של נוגדנים המזהים שינויים לאחר תרגום (PTM) על פפטידי היסטון. שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים מצומדים פלואורופורים משותקים עם שילובי PTM ידועים מטופלת בנוגדנים ספציפיים ל-PTM מטרה. תהליך זה מסייע לזהות את הספציפיות של הנוגדן למטרה ואת התגובתיות הצולבת הפוטנציאלית שלו עם PTM שאינם מטרה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

בדיקת מערך פפטידים היא בדיקת תפוקה גבוהה לזיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבון לחלבון. זה מאפשר מיפוי אינטראקציות מרובות של חלבון מטרה ויכול לשמש כשיטה לזיהוי אתרים למעכבים המכוונים לחלבון. כאן אנו מתארים פרוטוקול לסינון וניתוח מערכי פפטידים.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

שיטות למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo הופכות חיוניות לכל היבט של מחקר גנומי, אך הן מייגעות, יקרות וגוזלות זמן. כאן מוצגת מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים זמינה מסחרית המבצעת אוטומציה של משקעים חיסוניים של כרומטין למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo עם כמויות מוגבלות של תאים.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

ניתן להשתמש במערכי פפטידים המסונתזים בשיטת SPOT כדי לנתח את ספציפיות הסובסטרט של חלבון ליזין מתילטרנספראזות (PKMTs) ולהגדיר את ספקטרום הסובסטרט של PKMTs כדי להבין את תפקידם הביולוגי. פרוטוקול זה מתאר כיצד לסנתז מערכי פפטידים, לבצע מתילציה שלהם עם PKMTs ולנתח את התוצאות.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

כאן, המחברים מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל להגדרת אפיטופ אנטיגני ליניארי באמצעות נוגדן חד שבטי מטוהר וסריקת פפטידים באמצעות הכלאה של כתמי נקודות. לאחר מכן ניתן להשתמש באפיטופ שזוהה ביישומים טיפוליים ואבחנתיים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לטיהור של MHC class I ומתחמי פפטיד מדרגה II מקווי עכבר ותא אנושי המספקים נתוני אימונופטידומיקה באיכות גבוהה. הפרוטוקול מתמקד בהכנת דגימה באמצעות נוגדנים זמינים מסחרית.

אימונופטידומיקה: בידוד של עכבר ו- MHC אנושי Class I- ופפטידים הקשורים II לניתוח ספקטרומטריית מסה

וריאנטים גנטיים בבני אדם מסוג ספינדלין ממשפחת 4 (SPIN4) זוהו לאחרונה אצל חולים עם עודף התפתחות עצם, הפרעה התפתחותית חדשה. מוצגים פרוטוקול ותוצאות חדשות המתארות את הזיהוי הביוכימי של היסטונים מותאמים בהקשר של נוקלאוזומים כסובסטרטים של קישור SPIN4.

זיהוי היסטונים שעברו שינוי כסבסטרטים קשירים של בני משפחת הספינדלין האנושיים 4 (SPIN4) באמצעות מערכי פפטידים ומשיכת נוקלאוזום טבעית

למדו שיטה לניתוח ספציפיות נוגדנים היסטון באמצעות מערכי פפטידים. הטכניקה מספקת פרופילים מדויקים לבקרת איכות בביוכימיה כרומטין ומחקר אפיגנטי.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

גלה סרטונים נוספים