Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Xenotransplantat-Mausmodell für das Mantelzell-Lymphom zu etablieren, um Behandlungsstrategien für diese Erkrankung zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Hämatoonkologie zu beantworten, wie z.B. das therapeutische Ergebnis verschiedener Behandlungsstrategien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Wirkung von Medikamenten auf menschliche Lymphomzellen in vivo zu untersuchen.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie des Mantelzell-Lymphoms, da es mit diesem Modell nicht nur machbar, sondern auch bequem ist, die Wirkung der Therapie auf patientengewonnene Zellen zu untersuchen. Obwohl diese Methode Einblicke in therapeutische Aspekte des Mantelzell-Lymphoms geben kann, kann sie auch zur Untersuchung verschiedener Arten von Lymphomen eingesetzt werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, von Patienten stammende Xenotransplantate zu erhalten.

Als wir zum ersten Mal die Idee zu dieser Methode hatten, als wir die B-Zell-Migration in vivo untersuchen wollten und die Auswirkungen einiger Therapien auf diesen Prozess. Verdünnen Sie 12 Milliliter Blutprobe des Mantelzell-Lymphoms mit gleichen Volumina RPMI 1640 Medium. Invertieren Sie dann das Medium mit dem Dichtegradienten mehrmals, bevor Sie es verwenden.

15 Milliliter Dichtegradientenmedium werden in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aspiriert. Geben Sie mit Hilfe eines Aspirators die verdünnte Blutprobe vorsichtig und schonend auf das Dichtegradientenmedium, ohne die beiden Schichten zu vermischen. Schalten Sie dann die Bremsen aus und zentrifugieren Sie die Blutprobe bei 400 g für 40 Minuten bei Raumtemperatur.

Verwenden Sie eine sterile Pasteurpipette, um die mononukleären Blutzellen aus der mittleren Schicht zu aspirieren und in ein sauberes Röhrchen zu übertragen. Um die mononukleären Zellen zu waschen, fügen Sie drei Volumen steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 1 % fötalem Rinderserum zu einem geschätzten Volumen der Zellsuspension hinzu. Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals, um sie richtig zu mischen.

Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 400-500 g für 10-15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Zellpellet mit einer gepufferten Kochsalzlösung in einfacher Stärke und 1 % Rinderserumalbumin gewaschen. Zentrifugieren Sie die Probe.

Verwerfen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in ein oder zwei Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Zählen Sie dann die Anzahl der Zellen mit einem automatischen Zellzähler. Verdünnen Sie die Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pipettieren Sie die Zellen dann in ein Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen und geben Sie 100 Mikroliter Antikörpercocktail in die Zellsuspension.

Pipettieren Sie die Zellsuspension mehrmals vorsichtig, um sie richtig zu mischen. Dann inkubieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur in der laminaren Haube für 10 Minuten. In der Zwischenzeit die magnetischen Partikel im B-Zell-Anreicherungskit 30 Sekunden lang vortexen.

Geben Sie dann 150 Mikroliter der magnetischen Partikel in zwei Milliliter Zellsuspension. Inkubieren Sie das Magnetpulvergemisch der Zelle fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Stellen Sie das Probenvolumen auf 2,5 Milliliter ein, setzen Sie dann das Röhrchen in den Magneten und inkubieren Sie weitere drei bis fünf Minuten.

Nach der Inkubation wird die Zellsuspension in einer kontinuierlichen Bewegung aus dem am Magneten befestigten Röhrchen in einem neuen Röhrchen dekantiert. Zählen Sie dann die Gesamtausbeute an B-Zellen in der Suspension mit einem automatisierten Zellzähler. Um die Reinheit der angereicherten B-Zellen zu bestätigen, inkubieren Sie etwa 50.000 Zellen mit Anti-CD19-, CD20- und Anti-CD45-Antikörpern, die mit verschiedenen Fluorochromen gekoppelt sind, bei Raumtemperatur für 15-30 Minuten.

Waschen Sie dann die Zellen mit einem Milliliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung in einfacher Stärke und 1 % Rinderserumalbumin. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400-500 g für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Pellet in 200 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendieren.

Analysieren Sie die Reinheit der B-Zellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie, die bei dieser Methode in der Regel bei mehr als 90 % liegt. Suspendieren Sie die Zellen in 150 Mikrolitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einfacher Stärke. Injizieren Sie dann die Zellsuspension intravenös in die Schwanzvene von sechs bis sieben Wochen alten Mäusen, unabhängig von ihrem Geschlecht.

Die intravenöse Injektion der aus dem Blut des Patienten isolierten Lymphomzellen in die Schwanzvene der Maus ist ebenfalls entscheidend, um eine erfolgreiche Transplantation zu gewährleisten. Nachdem Sie die Mäuse in einer Kohlendioxidkammer geopfert haben, sammeln Sie die verschiedenen Organe. Anschließend werden die Organe auf einem 70-Mikron-Filter mit der Rückseite eines Spritzenkolbens mechanisch aufgemischt, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.

Alle Proben, mit Ausnahme von Blut zwischen 400 und 500 g, werden fünf Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Verwenden Sie einen Ammoniumchlorid-Kalium-Puffer in einer Stärke, um Blut-, Knochenmark-, Milz- und Leberzellen zu lysieren. Die Filterung von Zellen, die aus Organen stammen, die aus Mäusen isoliert wurden, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, bevor sie zum Durchflusszytometer gelangt, ist wichtig, um eine Verstopfung zu verhindern.

Verwenden Sie B-Zell-spezifische Antikörper wie Anti-CD19, CD20 und CD45, um die Zellen zu färben. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie erhielten die von jedem Organ stammenden B-Zellen die CD19-positiven, CD20-positiven und CD45-positiven Antikörper. Basierend auf den Gated Cells quantifizieren Sie die organspezifischen und transplantierten Tumorzellen, die aus dem Mantelzell-Lymphom injizierten Mäusen gewonnen wurden.

In dieser Studie wird eine Durchflusszytometrie durchgeführt, um die Reinheit von B-Zellen vor und nach der Anreicherung beim Mantelzell-Lymphom zu untersuchen. Zur Charakterisierung des mononukleären Mantelzell-Lymphoms werden B-Zell-spezifische Marker wie CD45, CD19, CD5, CD200, CD20, Kappa und Lambda verwendet. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt, dass die Zellen positiv für CD45, CD19, CD20 und CD5 gefärbt sind.

Und diese werden für die Charakterisierung ausgewählt. Zellen, die sich nicht für CD23 und CD200 gefärbt haben, werden ebenfalls ausgewählt. Der Grad der organspezifischen Transplantation wird untersucht, indem die Organe durch Durchflusszytometrie weiter aufbereitet und anschließend auf B-Zellen analysiert werden.

Hier ist eine vergleichende Darstellung des Transplantationsmusters gezeigt, das von zwei Patienten unter Verwendung von Organen wie Milz, Knochenmark und Leber erhalten wurde. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von drei Wochen durchgeführt werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, PBMCs, die für Xenotransplantate verwendet werden, anzureichern und die Mäuse regelmäßig auf Vitalerscheinungen wie zerzaustes Haar, gekrümmten Rücken, Lähmung der Hinterbeine und Gewichtsverlust zu überprüfen.

Nach diesem Verfahren könnten Xenotransplantate auf andere Arten von Lymphomen angewendet werden, z. B. neigen sie dazu, eine personalisierte Medizin durchzuführen. Nach ihrer Entwicklung könnte diese Technik den Weg für andere Forscher auf dem Gebiet der Hämatoonkologie ebnen, um die Möglichkeiten zur Etablierung von Mantelzell-Lymphomen zu erforschen, die von Patienten in immundefizienten NOD-SCID-Mäusen stammen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie von Patienten stammende PBMCs aufreinigen und sie zur Xenotransplantation immundefizienter Mäuse verwenden können, um die Strategie der Therapien zu verstehen.

Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einer primären menschlichen Blutprobe äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieser Verfahren immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen getroffen werden sollten.