アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

リープフロッグの全体的な目標は、胚形成に不可欠な遺伝子の変異株の作成を促進することです。この方法は、発生遺伝学やその他の分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、F1世代の必須遺伝子の変異体を取得できることです。

この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、Cas9-sgRNA複合体を使用して、1つの細胞段階でXenopus胚にマイクロインジェクションします。受精後4.5時間に達したら、胞胚の初期ステージ9で、摂氏25度のインキュベーターから胚を取り出し、室温で発生を継続させます。受精後5時間で移植を開始するには、パスツールピペットを使用して、注入されていない1つの胚を、移植片のレシピエントとして機能するくぼみを含む60ミリメートルのアガロース皿に移します。

また、1つのPGCドナー胚を皿に移します。鉗子を使用して、各胚からビテリンエンベロープを手動で除去します。そして、両方の胚を回転させて、植物極が見え、手術にアクセスできるようにします。

次に、ヘアループでレシピエント胚を安定させながら、眉毛ナイフの鋭い先端を表面のすぐ下の植物ポールに挿入します。そして、急速で上向きのスライス動作で、将来のボトルセルが形成されるゾーン内で、正方形の形に4つの浅い切開を行います。正方形の4つの辺が描かれたら、眉毛のヘアナイフを使用して、同様の切断動作を使用して、胚盤石の床までの距離の約1/3〜1/2の深さまで各切開を深くします。

レシピエント胚から栄養組織外植片を遊離するために、深部植物領域に1つ以上の水平切開を行います。次に、迅速に作業して、PGCドナー胚でこの手順を繰り返し、移植用の同様のサイズの植物組織断片を作成します。PGCを含む組織がドナー胚から除去されたら、眉毛のヘアナイフとヘアループを使用して、レシピエント胚に作成された開口部に外植片を配置します。

移植片の表面と平行に保持された眉毛のヘアナイフのシャフトを使用して、移植片をレシピエント胚の栄養面の開口部にそっと押し込みます。ヘアループを使用して、ドナー胚の死体をアガロース表面を横切ってウェルにそっとスライドさせます。死体の開いた傷がバルク液体に面していることを確認してください。

レシピエント胚を隣接するウェルにスライドさせ、同様に、移植された植物極組織がバルク液体に面していることを確認します。追加の胚を含むPGCの移植を繰り返して、胚が約早期の原腸期10に達するまで、より多くの移植枝肉ペアを作成し、移植が行われるときに胚を空の井戸に移します。移植片が所定の位置に治癒したら、通常は移植後30〜45分で、パスツールピペットを使用して、アガロースでコーティングされた24ウェルプレートのくぼみから個々のウェルに胚を非常に穏やかに移します。

胚を回転させて、植物柱を上にしてバルク溶液を向けて配置します。ドナーの死骸と移植レシピエントを隣接するウェルに配置して、胚ペアを追跡し、この情報を記録するのを支援します。次に、胚を含む24ウェルプレートを摂氏25度のインキュベーターに一晩移します。

翌日、各移植レシピエント(現在、尾芽の初期段階にある)を、新鮮なアガロースコーティングされた6ウェルプレートの個々のウェルに移動します。リープフロッグ胚を育て、テキストプロトコルに従って死体から得られたドナーDNAの分析を行います。リープフロッグは、生殖細胞系を変異対立遺伝子に効率的に置き換える動物を生み出すため、F1世代では変異表現型を得ることができます。

この表に示されているように、Blitzらは、メラノサイトおよび網膜ピトメンテーションに必要なチロシナーゼ遺伝子座を標的としたF0動物の大多数が、Tyrマイナスアルビノ動物との交配によって測定したドナー由来変異ゲノムの生殖細胞系伝播を100%示すことを報告しました。このビデオを見たので、Xenopus原始生殖細胞を移植する方法をよく理解しているはずです。