Name: 巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶ 巨大リポソームから膜ナノチューブを引き出す手法で、タンパク質と湾曲膜の相互作用を定量的に解析します。光ピンセットと顕微鏡を用いて膜の力学特性を測定し、エンドサイトーシスや細胞内輸送のメカニズム解明に貢献します。

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著者は、ブノワ ・ ソール、ダミアン キュヴリエ、ピエール ・ Nassoy、フランソワ Quemeneur、グループでカーボンナノ チューブ法を確立するギル Toombes 彼らの本質的な貢献のためにありがとうございます。脱法属する CNRS コンソーシアム CellTiss、Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038)、およびパリ科学 et レトル (ANR-10-アイデックス-0001-02)。F. C. ツァイ エンボ長期フェローシップ (ALTF 1527-2014 年)、マリー キュリー アクション (H2020 MSCA-場合 2014、プロジェクト膜・ エズリン アクチン) によって資金を供給されました。修士はシモンズの仲間社会短期やつです。

著者が明らかに何もありません。

膜からチューブを抜く方法、膜蛋白質システムに豊富な情報と、膜の基本的な機械的性質を測定するための手段だけではないが、タンパク質や膜間の結合に光を当てること曲率。サブミクロン リポソーム表面パッシベーションされた18,19につながれたと蛋白質をインキュベートするか観察することによって、タンパク質の膜カーブの効果を測定する他の技術が存在する導入部分で説明したように、尿細管ピペット吸引膜タンパク質20,21の注入の自発的形成。ここで説明した方法は、蛋白質密度、膜張力膜力など、同時にシステムの重要な物理的な測定値を提供するユニークなエンドサイトーシス幾何学的な直接接続を提供します。
メソッドの重要な制限はそれが構築し、試金に関連するすべてのコンポーネントを調整する簡単ではありません。しかし、共焦点顕微鏡の組み合わせ中、光ピンセットとマイクロマニピュレーション...

エンドサイトーシス、人身売買、糸状、感染症などの形成など多くの細胞プロセスは細胞膜1,2という形で劇的な変化を伴っています。セルで、いくつかの蛋白質は膜にバインドし、その形状を変更するこれらのプロセスに参加します。最も顕著な例は、本質的にドメイン3,4,5,6,7バー曲線特性を含む箱/アンフィフィシン/Rv (バー) 蛋白質家族のメンバーです。通常、彼らは表面と、多くの場合、両親媒性ヘリックスを 2 層も浅く挿入バー ドメインを付着する膜と対話します。形状、サイズ、および両親媒性ヘリックスの数と共に BAR ドメインの料金を決定します: (1) 膜の湾曲の方向 (すなわち、かどうか彼らは陥入や突起を誘発するが)、(2) 膜の大きさ曲率5,8。注記のうち、ここで正の曲率は曲線状の膜、すなわち、相互作用する粒子と負の膨らみのそれ以外の凸側として定義されます。さらに、蛋白質バーの定量的研究は、膜への影響は物理的なパラメーターのセットによって異なりますを明らかにした: 表面蛋白質、膜張力膜形状 (フラット対鋼管対球の密度図形)7。タンパク質バーこれらのパラメーターに応じてすることができます: (1) 膜の曲率のセンサーとしての機能、(2) 膜を曲げたり、(3) 膜切断7を誘発します。
膜再編のセルで、エンドサイトーシスなどの現象の定量的側面を勉強に関連するコンポーネントの数により生体内では非常に挑戦的です。セルに湾曲した膜を模倣した最小限のコンポーネントのin vitro再構成は、どのように膜カービング タンパク質の動作機構の理解を得るための手段を提供します。この記事では、膜カーボンナノ チューブ体外顕微操作、共焦点顕微鏡、光ピンセットを使用して再構成するプロトコルについて説明します。アプローチは、タンパク質、脂質、または小さい分子が湾曲した膜と対話する方法を定量的な方法で勉強する使用できます。脂質膜は、曲率が無視できる膜カービング結合分子のサイズと比較して、細胞膜のモデルとして使用されます。彼らは、脂質膜の水和と交流電流 (AC)10の下でそれを膨潤膜に小胞を形成する electroformation メソッド9を使用して準備されます。最も一般的な基質 Guv が栽培されているインジウムの錫の酸化物 (ITO) のいずれか半導べ電性皮膜や白金線 (Pt 線)11。この作品は、このメソッドは、バッファー12に塩の存在下で膜を作るの代替よりもはるかに良い動作するように示されている、Guv、Pt ワイヤ上育ちます。Electroformation プロトコルここでそれを再現するのに十分な詳細に説明しています、我々 は詳細13,14に、膜を作るのと同様、他の方法を記載されている以前の記事へ読者を参照します。私たちの手で Pt ワイヤ上 electroformation 正常にもたらした膜合成脂質のミックスや天然脂質から 〜 100 mM の NaCl を含むバッファーで抽出。さらに、成長過程における膜内タンパク質をカプセル化することが可能だったも。図 1 a; での例が electroformation 商工会議所を表示します。両側からす coverslips に封印できるポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) から作られたホルダーに挿入 2 ~ 10 cm ロング Pt ワイヤーが装備されている 1 〜 2 cm 離れて (図 1 a)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> 図 1: 実験的セットアップします。白金線に接続された電気コネクタの旦那 electroformation (A) 室。(B) 左: 顕微鏡を示す実験的システム、上記の目的は、2 つのマイクロ ピペット (左と右) 実験室マニピュレーターに取り付け、チューブを引っ張るとタンパク質の実験室に挿入インジェクション。右: 実験室のクローズ アップ ビューを吸引し挿入注入マイクロ ピペットの先端を示す目的上マウント。(C) A の注射器そのバックエンドでマイクロ ピペットに挿入される細いディスペンサーを装備しました。下部は、青の点線のアウトライン、ピペットでマイクロ ピペット内ディスペンサーのクローズ アップ ビューです。このシステムは、カゼイン ガラス表面にまた必要なとき鉱物油で塗りつぶしをバックアップすると、マイクロ ピペットを埋めるためです。(D) A システム μ L タンパク質溶液の量を吸引するために使用します。針は、注射器と注入マイクロ ピペットに接続されているチューブに接続されているです。マイクロ ピペット チップは慎重にタンパク質溶液に浸漬、マイクロ ピペットのチップを記入するので吸気します。マイクロ ピペットがパネル c. に示すシステムを使用して鉱物油で再び埋められます<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
7 からの半径に至るまで膜ナノチューブ nm ~ 数百 nm は、外部の力が、旦那から引っ張ることができます。このメソッドの細胞膜と小胞、曲げ剛性15,16などの弾性的性質を測定するために設計されました。最も最近の作品の方法は microinjecting プル カーボンナノ チューブ7,17近く蛋白質による曲面膜とタンパク質の相互作用を研究に拡張されました。他の方法は蛋白質の膜カービングを勉強するために開発されています。1 つの方法で蛋白質は不動態化された表面につながれた異なるサイズのリポソームと孵化させます。共焦点の顕微鏡を使用して、曲率による並べ替え18,19を示すことができます, リポソーム径の関数として蛋白質の結合を測定します。別の方法で蛋白質は尿細管20,21を自発的に誘発する能力を測定するマイクロ吸気 GUV 近く注入されます。このプロトコルで説明する方法は、エンドサイトーシスに関与する膜カービング蛋白質を研究に適してほとんどの蛋白質が通常の貨物を含む細胞膜の陥入を接続する前もって形成された膜ナノチューブに遭遇、平膜を基になります。さらに、このメソッドとは異なり、つなぎ縄でつながれた小さなリポソームを用いる試金で膜カーボンナノ チューブは継続的に接続されて膜;したがって、それは GUV、状況が予想される生体内力学的平衡です。したがって、基本的な膜の物理が適用され、我々 は我々 の測定22,23,24から機械的性質の茄多を推測できます。
このメソッドの完全な実装、必要な機器は、共焦点顕微鏡、光ピンセット、水タンク (図 1 b) に接続されている 1 つまたは 2 つのマイクロ ピペットに含まれます。すべての 3 つを組み合わせて、同時に力25をチューブの膜、膜の曲率、蛋白質の表面密度を測定し不可能です。マイクロ ピペット吸引は不可欠ですし、静水圧による吸引圧26を制御する水タンクに接続されているホルダーにガラス ピペットを挿入することによって簡単に構築します。マイクロ ピペットとホルダーは高精度動きの圧電アクチュエータを用いたマイクロマニピュレーターと、理想的には、一方向に制御されます。カーボンナノ チューブ、旦那は微小ビーズを引いて離れて、カーボンナノ チューブの作成にこだわった簡単に microaspirated を引く。この実装では、ビーズが27公開されたプロトコルに従うことによって構築することができます光ピンセットを用いて行われます。正確な力の測定を犠牲にして、光ピンセットとプル カーボンナノ チューブのさまざまな方法で調剤することが可能です。光トラップを構築するも困難な場合、または力の測定は必須ではありませんなど単に湾曲した膜蛋白質の好みをチェックしたい場合、2 番目のマイクロ ピペット28の先端に吸引ビーズを使用してチューブを引っ張ることが。また、重力29を使用してチューブを引くか、30,31をフローすることが可能です。さらに、共焦点顕微鏡必須ではありません。しかし、それは蛋白質の表面密度を測定するので勧めします。また、脂質膜力と緊張とは関係なくこうして、管内の蛍光強度からカーボンナノ チューブの半径を測定できます。蛍光から推論のチューブの半径は膜付着蛋白質25の存在のため確立された方程式から逸脱するこれらの量の間の関係は特に重要です。重要なは、1 つは管の曲率を測定するそれはできない、光学トラップと共焦点顕微鏡のはやれない。
このプロトコルで説明するメソッドは、様々 な末梢膜タンパク質ナノチューブ バー家族25,32,33,34 からの大抵それらの曲率による並べ替えを研究に使用されています.また KvAP に濃縮されて円錐形の貫通型カリウム チャネルは、タンパク質35バーとしてカーボンナノ チューブを同じ方法で湾曲したが示されました。膜内タンパク質をカプセル化する方法を最適化することによって負の曲率とタンパク質の相互作用は、最近よく36として研究されています。タンパク質足場25,37の形成を明らかにし、どちらかライン テンション38, タンパク質ダイナミン39、またはバーの膜切断機構の研究にさらに、このメソッドが使用されていますタンパク質40,41。蛋白質に加えて小さな分子やイオンで曲率も誘導できます。このメソッドを使用すると、カルシウム イオンは塩無料条件42の下で正の曲率を誘導するために示されていた。興味深いことに、脂質が demixing ポイント43,44近くにある組成のだけが並べ替え、曲率を受けることができることはまた示します。合計では、メソッドは、方法のいずれかの積分膜成分 (例えば脂質や膜貫通タンパク質) の調査に興味を持って研究によって使用することができますまたは末梢分子をバインド (または内部または外膜) の対話開放円筒曲面膜、機械的かつ定量的視点から。それはまた22,23,45膜自体の機械的性質の測定に興味のある方のものは。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DOPC)</td><td>Avanti</td><td>850375</td><td>図3のデータで使用されている脂質の例</td></tr><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ビオチニル(ポリエチレングリコール)-2000] [DSPE-PEG(2000)-ビオチン</td>]<td>Avanti</td><td>880129</td><td>ビオチン化脂質</td></tr><tr><td>BODIPY-TR-C5-セラミド</td><td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td><td>D7540</td><td>蛍光脂質</td></tr><tr><td>BODIPY- FLC5-ヘキサデカノイルホスファチジルコリン(HPC*)</td><td>分子プローブ(サーモフィッシャー)</td><td></td><td>タンパク質密度校正</td></tr><tr><td>卵L-&α用蛍光脂質 L-&α;-ホスファチジルコリン(eggPC)</td><td>Avanti</td><td>840051</td><td>チューブ半径定数の校正に使用されます</td></tr><tr><td>&β;-牛乳(>99%)からのカゼイン</td>マイクロピペットの不動態化に使用される<td>シグマAldrich</td><td>C6905</td><td>実験チャンバー</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>D(+) グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>Loser</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Ptワイヤー、直径0.5 mm、純度99.99%</td><td>Goodfellow USA</td><td></td><td>GUV電気形成</td></tr><tr><td>機能発電機</td><td></td><td>n/a</td>に使用されるPT005139 <td>GUV電気形成</td></tr><tr><td>パテシーラント</td><td>Vitrex(CMLフランスから)</td><td>CRIT 140013</td><td>電気形成チャンバーをシールするために使用される電気形成チャンバー</td></tr><tr><td>バスソニケーターn</td><td></td><td>/ a</td>を電気<td>形成チャンバーをきれいにするのに役立ちますが、重要ではありません</td></tr><tr><td>ニコンTE2000倒立顕微鏡、eC1共焦点システム(ニコン)、2本のレーザーライン(&λ; = 488 nmおよび543 nm);5Wイッテルビウムファイバー連続波レーザー(&ラムダ>1070nmによって誘導された光ピンセット;IPG GmBH Germany)</td><td></td><td></td>光ピンセット、マイクロマニピュレーター<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>、ホ</td><td></td></tr><tr><td>ウケイ酸キャピラリー(内径0.78mm、外径1mm</td>)を搭載した共焦点顕微鏡システムの一例<td>Harvard apparatus</td><td>30-0036</td><td></td></tr><tr><td>micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2100</td><td></td></tr><tr><td>microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-800</td><td></td></tr><tr><td>圧電アクチュエータ</td><td>Physik Instrumente</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンストレプトアビジンコーティングビーズ(直径3.2&マイクロ;m)</td><td>スペロテック</td><td>SVP-30-5</td><td></td></tr></tbody></table>

巨大リポソームの膜カーボンナノ チューブを引っ張ってください。

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

細胞膜の再編は、エンドサイトーシス、人身売買、糸状等の形成など多くの細胞現象の不可欠な部分です。多くの異なった蛋白質に関連付ける曲面膜感覚または膜の曲率を誘発する能力のため。通常、これらのプロセスは複雑すぎるために、細胞の定量的研究し蛋白質の多数を含みます。エンドサイトーシスの首などの曲線の細胞構造を模倣した、曲線状の膜の in vitro再構成するプロトコルについて述べる。巨大リポソーム (GUV) 小嚢は、ピペット吸引がその内部圧力と表面張力を制御、細胞膜のモデルとして使用されます。光ピンセットによる旦那のポイント引き力を適用するには、平膜に接続されている高曲率のカーボンナノ チューブが作成されます。このメソッドは、曲げ剛性などの脂質膜の基本的な機械的性質を測定する伝統的に使用されています。近年、タンパク質が膜の湾曲や形状および膜の力学に影響する方法と対話する方法の研究に展開されています。マイクロマニピュレーション、マイクロインジェクション、光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせたシステムは、膜の曲率、膜張力および蛋白質の表面密度の測定を同時にできます。これらの測定からタンパク質膜システムの多くの重要な機械的および形態学のプロパティを推測できます。さらに、我々 は生理的塩濃度および分類された蛋白質と脂質の蛍光強度から膜タンパク質の表面密度を定量化する手法の存在下で膜を作成するプロトコルをレイアウトします。

チューブを抜く実験膜に関する重要な力学的情報を与えることができます。旦那50,51 から引き出されたチューブ式のタンパク質や他の分子膜膜曲率を持つカップルを強制的に、Canham Helfrich ハミルトニアンを用いた膜張力チューブの半径を関連付けることができますがない場合
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(関係式 1)
どこ<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq4v3.jpg">膜管、曲げ剛性、 <em...

多くのタンパク質の細胞感覚し、膜の曲率を誘発します。湾曲した膜体外タンパク質または任意曲率活性分子の相互作用を研究する脂質小胞から膜ナノチューブをプルする方法について述べる。

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

このナノチューブ引き抜き法の全体的な目標は、目的の特定のタンパク質と高度に湾曲した膜との間の相互作用を定量的に研究することです。この方法は、エンドサイトーシスや細胞内輸送など、細胞膜の生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術により、タンパク質がどのように湾曲した膜に結合し、それらを相互に変形させるかを直接定量化することができます。当初、この方法は脂質膜の基本的な機械的特性を測定するために使用されていました。最近では、タンパク質膜相互作用、特にタンパク質形成膜の重要なメカニズムを解明するために応用されています。まず、電気形成チャンバーの白金線から直接巨大な単層小胞を採取します。実験チャンバーを構築するには、金属製のベースに1mm間隔で2つの長方形のガラスカバーを置き、ガラスマイクロピペットの先端が少なくともチャンバーの中心に到達するのに十分な大きさの開口部を長辺に沿って残します。実験チャンバーとガラスマイクロピペットの両方に、気泡を避けながら、高純度のβ-カゼイン溶液を1ミリリットルあたり5ミリグラムで満たします。チャンバーが不動態化されている間に、対物レンズの中央にある光学顕微鏡に取り付け、吸引マイクロピペットの先端を長辺に沿った開口部を通して、先端が対物レンズより上に来るまで挿入します。吸引圧力がゼロに近づくように水タンクのレベルを調整し、適切な実験濃度で実験バッファーに溶解した目的分子を注入マイクロピペットに充填します。インジェクションマイクロピペットをマイクロマニピュレーター内に取り付け、実験チャンバーの反対側からマイクロピペットを挿入します。インキュベーションの終了時に、ベータカゼイン溶液をチャンバーから取り出し、実験バッファーでチャンバーを数回すすぎます。次に、数マイクロリットルの小胞溶液をチャンバーに加え、続いて数マイクロリットルのストレプトアビジン被覆ビーズを、最終濃度が10の0.1倍になり、体積あたりのビーズ率がマイナス3%以下になるようにします。小胞とビーズがチャンバーの底に落ち着いたら、実験用緩衝液を約15分間蒸発させ、その時点で小胞が光学顕微鏡下で目に見えて波打つはずです。小胞が適切にフロッピーになったら、ピペット内の膜の長さがピペットの半径以上になるまで、個々の小胞をマイクロピペットに吸引します。適切なサイズの吸引舌が特定されたら、チャンバーの開放端を鉱物油で密封します。吸引圧力のゼロ位置を設定するには、吸引ピペットの端をビーズの近くに置き、ビードがピペットに吸い込まれたり吹き飛ばされたりしないように水タンクの高さを調整します。水の高さを調整することは、マイクロピペットで吸引される小胞の膜張力を制御するために重要です。小胞を吸引し、マイクロピペットを壊さずにマイクロピペットを上に移動して焦点を合わせないようにします。光ピンセットを使用して、チャンバーの底から約20マイクロメートル離れた場所にビーズをトラップします。小胞をビーズから離れて焦点を合わせ、光学トラップと位置合わせし、ビーズの動きを1〜2分間記録して平衡位置を測定します。マイクロピペット内の圧力をできるだけ下げて小胞を失わずに膜の張力を下げ、小胞をビーズに約1秒間慎重に接触させてストレプトアビジン-ビオチン結合を確立します。次に、ピエゾアクチュエータを使用して、小胞をゆっくりと引き戻してナノチューブを作成します。吸引圧力を上げて吸引舌を再現し、チューブを吸引ピペットの軸内に位置合わせします。チューブと小胞に完全に焦点を合わせ、30ヘルツの取得速度でのビーズの動きとゼロ位置に対する水タンクの高さを明視野顕微鏡で数分間記録します。すべての画像を取得したら、異なる吸引圧力と膜張力でのビーズの動きを再度記録します。目的のタンパク質または分子を注入するには、光学トラップ内のビーズが乱されないように注意しながら、注入マイクロピペットをナノチューブの近くに持ってきて、1〜2パスカルの圧力でタンパク質を穏やかに注入します。タンパク質の結合が平衡化した後、裸の膜で示されたように、添加したタンパク質の存在下で段階的な測定を繰り返します。100%DOPC小胞から引き出されたナノチューブの力と半径の測定は、光トラップ内のビーズの変位と蛍光強度からの半径から測定されるため、膜の曲げ剛性を計算する2つの方法を提供します。BARまたはカリウムチャネルタンパク質が、その下にある小胞上の膜チューブ上で相対的に濃縮されていることは、タンパク質が湾曲した膜に結合する可能性が高いことを示しています。実際、N-BARタンパク質のエンドフィリンA2がメンブレンに結合すると、チューブの力が徐々にゼロになり、チューブを安定に保つ3次元の足場が形成されることを示しています。この手順に続いて、例えば、膜チューブ上のタンパク質組織を検出するための高解像度顕微鏡法や、タンパク質移動度を測定するための単一粒子追跡など、他の技術を組み合わせて追加の質問に答えることができます。

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生物学

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膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

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蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

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自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

プロトコルの目的は、マイクロピペット吸引によって巨大小胞の膜機械的特性を確実に測定することである。...

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このプロトコルは、巨大な単層脂質小胞と組み合わせて滑空キネシン運動性を使用して脂質ナノチューブネットワークを作製するためのプロセスを記載している。...

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