Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

El objetivo general de este procedimiento es aislar las bacterias intactas y enriquecidas que contienen fagosomas. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como los cambios en la maduración de los fagosomas y el procesamiento de antígenos cuando los microorganismos patógenos invaden las células huésped. La principal ventaja de la técnica es que produce bacterias de alta calidad que contienen fagosomas mediante pasos sencillos y sin necesidad de equipos especializados.

Las personas nuevas en el método lo encontrarían técnicamente accesible en comparación con las no metodologías. La primera vez que tuvimos la idea de desarrollar este método fue cuando estudiábamos los mecanismos por los cuales los patógenos intracelulares secuestran los fagosomas para su beneficio. La comprobante de este procedimiento estará a cargo de Saray Gutiérrez, postdoc de mi laboratorio.

Para iniciar el cultivo de Salmonella Typhimurium, use un asa de bacterias para inocular una sola colonia bacteriana en 5 mililitros de caldo de infusión cerebro-corazón. Luego incube la suspensión en una incubadora a 37 grados centígrados durante la noche mientras agita. Transfiera un mililitro de esta suspensión bacteriana a 19 mililitros de caldo BHI en un matraz cónico al día siguiente.

Incubar de nuevo en una incubadora a 37 grados centígrados mientras se agita. Cuando el OD600 alcance uno, retire el matraz de la incubadora y transfiera el cultivo a un tubo de 50 mililitros. A continuación, centrifugar el tubo a 5400 x G a 4 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en 10 mililitros de PBS estéril. Después de repetir la centrifugación una vez, vuelva a suspender el pellet en 4,9 mililitros de PBS. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de enlace de biotina recién preparada a la suspensión bacteriana.

Después de dividir esta suspensión en cinco tubos de 1,5 mililitros, incubar en un bloque térmico a temperatura ambiente con agitación constante a 350 rpm durante dos horas. Después de centrifugar los tubos a 15.000 x G a temperatura ambiente durante diez minutos, deseche el sobrenadante. Después de dos pasos más de centrifugación y la eliminación completa de la solución de enlace de biotina, vuelva a suspender esta bacteria codificada con biotina en un PBS estéril de un mililitro en un solo tubo de 1,5 mililitros.

Transfiera 100 microlitros de solución de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina a un tubo nuevo de 1,5 mililitros y colóquelo en una rejilla magnética durante cinco minutos. Después de retirar el disolvente del tubo, retire el tubo de la rejilla magnética. A continuación, vuelva a suspender las perlas que quedaron en el tubo con un mililitro de suspensión bacteriana codificada con biotina.

Incubar el tubo en un bloque térmico a temperatura ambiente durante una hora mientras se agita a 350 rpm. A continuación, coloque el tubo en la rejilla magnética durante cinco minutos. Utilice una pipeta para eliminar las bacterias que no se adhirieron a la pared y transfiéralas a un nuevo tubo etiquetado como bacterias no codificadas.

El tubo con perlas magnéticas adheridas a la pared contiene bacterias codificadas con biotina estreptavidina. Retire el tubo con bacterias codificadas con biotina estreptavidina de la rejilla magnética y vuelva a suspenderlo en un mililitro de PBS estéril. Después de que el tubo haya estado en la rejilla magnética durante cinco minutos, retire el PBS.

Finalmente, vuelva a suspender las bacterias codificadas con biotina estreptavidina lavadas en 500 microlitros de PBS estéril y etiquete el tubo como bacterias codificadas. El día anterior a la infección, se colocaron BMDM completamente diferenciados en una placa de seis centímetros en RPMIs suplementados con un diez por ciento de FBS. Al día siguiente, centrifugar la suspensión bacteriana codificada a 15.000 x G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos.

Después de retirar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet bacteriano en medio RPMI suplementado con un diez por ciento de FBS. Retire el medio de los BMDM y agregue cinco mililitros de suspensión bacteriana codificada en el medio RPMI para infectar las células. Para sincronizar la fagocitosis, incubar a temperatura ambiente durante diez minutos.

Luego, para iniciar la fagocitosis, incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al cinco por ciento durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el medio de los platos y lave las células tres veces a RPMI para eliminar las bacterias no internalizadas. Para matar cualquier bacteria no fagocitada a diez mililitros de RPMI que contiene diez por ciento de FBS en 50 microgramos por mililitro de gentamicina.

Finalmente, incube los BMDM infectados a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al cinco por ciento hasta el punto de tiempo deseado. En primer lugar, prepare el volumen de tampón de aislamiento de fagosomas A necesario añadiendo DTT y citocalasina B justo antes de su uso y los inhibidores de la proteasa y la fosfatasa según lo recomendado por el fabricante. Retire el medio de las células infectadas en el momento deseado y lave las células con PBS estéril precalentado a temperatura ambiente.

A continuación, añada 750 microlitros de tampón de aislamiento de fagosomas A a la placa e incube en hielo durante 20 minutos. Recuerde mecer el plato de vez en cuando. A continuación, agregue 250 microlitros de tampón de aislamiento de fagosomas B y luego agite las placas para asegurarse de que el tampón cubra completamente la superficie.

Raspe suavemente las células con un policía de goma para quitar las células del plato y transfiéralas a un tubo preenfriado de 1,5 mililitros. Luego use una jeringa de un mililitro para pasar la suspensión celular a través de una aguja de calibre 26 al menos 15 veces. A continuación, coloque la suspensión de la celda en el bastidor magnético durante cinco minutos.

Las partículas unidas a las perlas magnéticas son fagosomas que contienen S. Typhimurium codificado. A continuación, transfiera la suspensión que contiene el resto de los componentes celulares a un nuevo tubo de 1,5 mililitros etiquetado como Cytosol. Retire el tubo que contiene fagosomas aislados de la gradilla y vuelva a suspenderlo en un mililitro de PBS estéril.

Vuelva a colocar el tubo en la rejilla magnética durante cinco minutos y luego retire el PBS. Después de repetir este lavado con PBS una vez, retire el PBS y, finalmente, vuelva a suspender los fagosomas que contienen S. Typhimurium en el tampón requerido. Para evaluar la efectividad de la biotinilación de S. Typhimurium mediante microscopía confocal, los BMDM se infectaron con mCherry S. Typhimurium marcado con biotina.

Después de la fijación e incubación con Cy5-Streptavidin, la biotinilación exitosa fue confirmada por la señal fluorescente de Cy5-Streptavidin. Esta señal se observó exclusivamente en mCherry S.Typhimurium biotinilado, mientras que no hubo señal en mCherry S.Typhimurium no biotinilado. El análisis de inmunobloques de fagosomas aislados mostró un enriquecimiento significativo de mCherry que expresa S. Typhimurium en fagosomas en comparación con la fracción citosólica.

El análisis de inmunobloqueo utilizando marcadores de endosomas y lisosomas en fagosomas aislados mostró un enriquecimiento de los marcadores probados en fagosomas aislados cuatro horas después de la infección en comparación con 30 minutos después de la infección. Cuando se aplicó este protocolo a Staphylococcus aureus, se demostró una biotinilación exitosa de GFP que expresa S. aureus. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora y media dependiendo del tiempo de incubación elegido para la infección por el investigador.

Para garantizar el éxito del aislamiento de bacterias que contienen fagosomas, asegúrese de que los tampones contengan las concentraciones indicadas y que las placas estén mecidas para garantizar la cobertura homogénea de las células. Además, tenga cuidado al raspar las células y al pasar la suspensión celular a través de la aguja. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas como la proteómica o la metabolómica con fagosomas aislados para estudiar la alteración causada por patógenos bajo factores patogénicos implicados.