利用荧光寿命成像显微镜观察细胞内SNARE的运输

本实验的总体目标是在活细胞中可视化SNARE蛋白复合物的形成过程。该方法有助于解答膜运输领域中的关键问题，例如鉴定催化特定细胞器运输步骤的SNARE蛋白组合。该技术的主要优势在于能够直接观察SNARE蛋白在细胞内形成复合物的具体位置。

本实验中，将900,000个HeLa细胞分装至三个Eppendorf管中用于转染。按照文本方案所述，使用以下构建体对细胞进行转染：样品一转染syntaxinin-4-mCitrine构建体，样品二转染syntaxinin-4-mCitrine和VAMP3-mCherry，样品三转染同时融合了mCitrine和mCherry的syntaxinin-3构建体。

在细胞培养箱中，于37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用含10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌剂的高糖DMEM培养基将转染后的细胞培养过夜。次日，吸除培养基，用活细胞成像培养基洗涤细胞一次，持续两分钟；随后将细胞置于新鲜的成像培养基中。

开始此操作时，将样品二置于加热载物台上，温度设为 37 摄氏度，在具备脉冲激发光源（用于供体荧光团）和时间分辨数据采集功能的时间域荧光寿命成像共聚焦显微镜下进行观察。每次进行荧光寿命成像显微术（FLIM）测量之前，选择一个可见表达 mCitrine 和 mCherry 标记的 SNARE 蛋白的细胞，并同时激发两种荧光团，记录一幅 256 × 256 像素的共聚焦图像。通过点击“运行 FLIM”来记录一幅 FLIM 图像，该 FLIM 图像的尺寸和空间分辨率应与先前记录的共聚焦图像相同。

进行全细胞荧光寿命成像分析时，应记录至少50,000个光子；若按像素计算，则每个像素至少记录400个光子。进行FLIM测量时，需确保成像位置距离玻璃表面至少一微米，以避免反射信号干扰。对样品二中的多个细胞重复成像，并对样品一和样品三中的细胞也进行同样操作。

接下来，将一块干净的玻璃盖玻片放置在显微镜载物台上，用于记录仪器响应函数（IRF）。将发射检测器的单色仪调节至激发波长，然后点击“运行FLIM”按钮，通过玻璃盖玻片的背向散射信号记录一幅FLIM图像。光子记录将通过PT32ICS转换软件转换为FLIM图像。

配置软件，将输出设置为 ImageJ 以生成荧光寿命成像（FLIM）图像。将图像尺寸设置为 256 × 256 像素，通道设置为两个。

按下转换并加载一个或多个光子轨迹。按住控制键以选择多个光子轨迹。FLIM 图像应生成在保存光子轨迹的同一文件夹中。

首先打开具备反卷积拟合功能的数据分析软件程序。导入包含每个光子轨迹直方图的文本文件。重新组织表格，使仪器响应函数（IRF）位于第二列，紧邻A列中的时间值。通过选中所有列来评估所记录光子轨迹的质量。

请勿分析具有高反射峰的光子轨迹。此处展示了一个示例。按住控制键，选择包含经质量控制的寿命直方图以及B列中IRF的所有列，然后加载非线性拟合。

通过将该函数添加到分析软件中，加载去卷积拟合函数。选择拟合函数文件。该函数使用与仪器响应函数（IRF）进行去卷积的单指数衰减函数来拟合荧光寿命直方图。

对拟合曲线进行X轴缩放。按“拟合”按钮以拟合曲线，这将完成拟合并生成一个报告表，该表位于数组中，包含荧光寿命的偏移量和振幅。

它还将生成包含拟合曲线及拟合残差的数据表。图中显示的是表达仅 syntaxin4-mCitrine、syntaxin4-mCitrine 与 VAMP3-mCherry 共表达，或 syntaxin3-mCitrine-mCherry 串联构建体的 HeLa 细胞的代表性共聚焦图像。在这些相应的荧光寿命图像中，颜色表示平均表观荧光寿命。

随后，这些图像与mCitrine供体荧光团的荧光强度进行了卷积。接下来是使用双指数衰减函数拟合的相同图像。像素颜色表示估计的与VAMP3形成复合物的syntaxin 4所占的比例。

通过测量玻璃-水界面的背向散射来测定实验装置的仪器响应函数。展示了仅表达 syntaxin4 mCitrine、共表达 syntaxin4 mCitrine 与 VAMP3 mCherry，以及表达 syntaxin3 mCitrine-mCherry 串联构建体的细胞的全细胞寿命直方图。图 E 显示了图 B、C 和 D 衰减曲线的叠加结果。插图显示了相同的图形，但 Y 轴采用对数刻度。

在显微镜盖玻片表面过近处记录的荧光寿命直方图会产生较大的反射峰，如黄色阴影区域所示。最后展示的是采用双指数衰减函数进行典型拟合的寿命直方图。一旦掌握，若操作得当，该技术可在两到四小时内完成。

在进行该实验操作时，重要的是要记住同时记录多个细胞，因为供体和拦截体SNARE蛋白的表达水平可能影响其寿命。完成该操作后，可对细胞进行激活，以回答与SNARE介导的膜运输中细胞类型特异性重定向相关的问题。该技术建立后，为膜运输领域的研究人员探索所有真核细胞中细胞器运输的细胞间通路奠定了基础。

观看本视频后，您应能充分理解如何记录和分析荧光寿命成像（FLIM）数据。请务必注意，操作基因修饰生物体和高功率激光器可能存在极高风险，因此在进行该实验时，必须始终采取适当防护措施，例如佩戴手套和护目镜。