Un'analisi semplice e a basso costo per la misurazione della deambulazione in modelli murini di distrofia muscolare
29 dicembre 2017
Questo protocollo descrive un sistema flessibile, a basso costo per la misurazione della deambulazione del mouse in un'analisi di attività di campo aperto. Vi mostriamo un saggio di deambulazione di 6 minuti basato su questo sistema rileva una diminuzione nel movimento volontario nei topi mdx che distingue accuratamente miglioramento in un salvataggio di muscolo-specific di questi animali.
L'obiettivo generale di questo saggio è misurare l'ambulazione volontaria in modelli murini di distrofia muscolare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della distrofia muscolare riguardo alla progressione della debolezza muscolare nei modelli murini di distrofia muscolare e all'efficacia di potenziali terapie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce una misurazione non invasiva e riproducibile dell'attività animale facilmente adattabile a molteplici contesti di ricerca.
In una stanza tranquilla a temperatura controllata e a un orario costante della giornata, posizionare una telecamera su una griglia metallica sopra la camera di attività per consentire la registrazione dell'intera area e pulire la camera con un disinfettante. Immediatamente prima della registrazione dell'attività, far afferrare al topo la sbarra del dinamometro digitale e tirare delicatamente all'indietro finché la sbarra non viene rilasciata. Registrare la tensione massima in newton per ogni prova.
Con un minuto di riposo tra una prova e l'altra. Immediatamente dopo il saggio di forza della presa, posizionare il topo nella camera e avviare la registrazione video, permettendo al topo di esplorare liberamente. Dopo sei minuti, interrompere la registrazione e riportare il topo nella sua gabbia di provenienza.
Per l'analisi di tracciamento dei dati video, aprire innanzitutto la registrazione nel software di editing video appropriato e impostare la velocità al doppio. Esportare il video decimato in formato file mp4 per l'analisi di tracciamento e aprire il video nel programma di analisi video appropriato. Per impostare la calibrazione della registrazione video, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea lungo un lato della camera.
Fare clic con il tasto destro sulla linea, selezionare calibra misura e inserire la dimensione reale del lato della camera in centimetri. Per iniziare il tracciamento semiautomatico della posizione del mouse, fare clic sul cursore di spostamento. A partire dal fotogramma iniziale del video, fare clic con il tasto destro sul punto da tracciare.
Il punto di tracciamento verrà contrassegnato con un cerchio blu. Utilizzare la freccia destra sulla tastiera per avanzare il fotogramma. Il punto di tracciamento dovrebbe spostarsi automaticamente in base alla posizione della base della coda.
Se la posizione di tracciamento non è allineata con il punto di interesse in un determinato fotogramma, allineare manualmente il cerchio blu alla posizione di tracciamento. Una volta tracciato l'intero video, salvare il video e la sovrapposizione del tracciato e selezionare "esporta in foglio di calcolo" per esportare i dati posizionali del tracciamento. In linea con i risultati riportati da saggi simili, i topi mdx privi di distrofina sottoposti a un protocollo di esercizio immediatamente prima del test mostrano un movimento volontario significativamente inferiore in un test del campo aperto della durata di sei minuti, rispetto agli animali di tipo selvatico.
In effetti, dopo lo sforzo moderato di una prova di forza della presa, i topi mdx di solito sono rimasti immobili nei primi minuti del protocollo di deambulazione, con un lieve aumento del movimento tra il quarto e il quinto minuto. Tuttavia, confrontando animali di tipo selvatico e mdx senza una prova di esercizio, non vengono rilevate differenze nella distanza percorsa. I topi mdx transgenici per l'espressione della utrofina sono indistinguibili dagli animali di tipo selvatico, senza differenze significative nella distanza totale percorsa o in nessuno dei punti temporali cumulativi osservati.
Per determinare l'effetto della riduzione della frequenza di campionamento, è stata misurata la distanza totale percorsa in un minuto di video alla frequenza massima di fotogrammi e confrontata con le misurazioni di distanza ottenute da versioni sottocampionate del set di dati. Ridurre la frequenza dei fotogrammi della metà ha diminuito la distanza misurata del 5% rispetto alla distanza originale calcolata. L'accuratezza della distanza misurata diminuisce bruscamente oltre questo punto, sebbene anche set di dati fortemente decimati approssimino ancora strettamente il percorso dell'animale, evidenziando l'importanza di considerare la frequenza dei fotogrammi e l'elaborazione del segnale nella valutazione dell'attività animale e dimostrando che un'elevata risoluzione spaziale può essere mantenuta anche nei dati video sottocampionati.
Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare e analizzare l'andatura del topo in un ambiente di campo aperto. Una volta padroneggiata, questa analisi può essere completata in 15-30 minuti se eseguita correttamente. Questo saggio a basso costo e non invasivo permette ai ricercatori di esaminare l'attività motoria in modelli murini di distrofia muscolare, e può rappresentare un primo passo informativo per ulteriori misurazioni funzionali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un sistema flessibile ed economico per misurare la deambulazione del topo in un test di attività in campo aperto. Il metodo fornisce una misurazione non invasiva e riproducibile dell'attività animale, che può essere adattata a diverse impostazioni di ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sulla distrofia muscolare
- Analisi comportamentale
Sfondo
- Il saggio misura la deambulazione volontaria in modelli murini di distrofia muscolare.
- Affronta questioni fondamentali riguardo alla progressione della debolezza muscolare.
- La tecnica è stata progettata per valutare l'efficacia di potenziali terapie.
- La registrazione viene effettuata in un ambiente controllato per garantire coerenza.
Scopo dello studio
- Misurare il movimento volontario nei topi mdx.
- Valutare l'impatto di interventi specifici per il muscolo.
- Fornire informazioni sulla progressione della distrofia muscolare.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di una telecamera posizionata sopra la camera di attività per la registrazione.
- Pulizia della camera con disinfettante prima delle prove.
- Permettere al topo di afferrare una sbarra verticale per misurare la tensione massima.
- Registrazione dell'attività durante un saggio di ambulazione della durata di 6 minuti.
Risultati principali
- Il sistema rileva diminuzioni del movimento volontario nei topi mdx.
- Distingue con precisione i miglioramenti dovuti al recupero specifico del muscolo.
- I risultati sono riproducibili in diversi esperimenti.
- Il metodo è adattabile a diverse impostazioni di ricerca.
Conclusioni
- Questo saggio è efficace per lo studio della distrofia muscolare nei topi.
- Fornisce dati preziosi sull'efficacia di potenziali trattamenti.
- L'approccio è flessibile e può essere utilizzato in diversi ambienti di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione dell'ambulazione volontaria in modelli murini fornisce un'analisi traslazionale della funzione motoria nella distrofia muscolare, direttamente analoga a endpoint clinici come il test del cammino di 6 minuti. Questo saggio basato su video, a basso costo, consente una valutazione riproducibile e non invasiva dell'evoluzione della malattia e della risposta terapeutica negli studi preclinici. Rilevando deficit di attività nei topi mdx privi di distrofina e il loro recupero mediante espressione di utrofina, il metodo supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci per le malattie neuromuscolari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche quantificando la deambulazione volontaria come parametro funzionale della forza muscolare in modelli distrofici.
- Valore operativo: Consente la riduzione del rischio biologico mediante una correlazione genotipo-fenotipo riproducibile nei topi mdx rispetto ai gruppi wild-type e recuperati.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio terapeutico distinguendo gli interventi efficaci (ad esempio, transgene dell'utrofina) che normalizzano i livelli di attività fino a quelli dei soggetti wild-type.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per lo screening di composti successivi utilizzando metriche standardizzate di ambulazione in campo aperto.
- Riproducibilità: Fornisce output quantitativi basati su distanza e tempo, adatti alla standardizzazione del saggio tra diversi laboratori.
- Scalabilità: Sfrutta software open source gratuito e hardware accessibile per consentire il riutilizzo della piattaforma in diversi contesti di ricerca senza l'impiego di attrezzature specializzate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella deficit di deambulazione rilevanti per il paziente, fornendo una continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
- Valutazione meccanicistica dei rischi: Chiarisce se gli effetti osservati derivano da un ripristino specifico del muscolo o da cambiamenti aspecifici dell'attività.
- Decisioni basate sulla valutazione del rischio: Fornisce informazioni per criteri di prosegui/non prosegui correlando il recupero della deambulazione con l'interazione con il bersaglio e la modulazione del percorso metabolico.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di un composto promettente, offrendo un collegamento funzionale tra meccanismi molecolari e risultati fenotipici nei modelli di distrofia muscolare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi collegando interventi genetici o farmacologici a modifiche misurabili nel movimento volontario.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso un tracciamento riproducibile basato su video, generando parametri quantificabili dell'andatura per la valutazione dei composti.
- Analisi: Produce flussi di dati spaziali e temporali che consentono ai gruppi di lavoro di confrontare l'attività locomotoria tra diversi genotipi, trattamenti e punti temporali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica riproducendo valutazioni cliniche dell'andatura, facilitando l'allineamento dei biomarcatori e la modellizzazione predittiva.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile e a basso costo per i test dell'andatura, riducendo la dipendenza da strutture centralizzate specializzate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nei saggi della funzione motoria.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie al tracciamento open source e a condizioni ambientali controllate.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale eliminando la necessità di sistemi costosi di tracciamento del movimento pur mantenendo la qualità dei dati.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sul recupero funzionale dei fenotipi della deambulazione in modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di base nella registrazione video e nell'utilizzo di software di tracciamento open source (ad esempio, allineamento manuale fotogramma per fotogramma).
- Si basa su apparecchiature di imaging standard e su controlli ambientali costanti (illuminazione, temperatura, ora del giorno).
- Necessita di un rigoroso rispetto del protocollo da parte di tutti i membri del team per garantire la riproducibilità tra diversi siti e operatori.
- Richiede considerazioni adattative per diverse dimensioni delle camere, ceppi di topi e livelli di attività.
- Comporta compromessi tra frequenza dei fotogrammi e accuratezza delle misurazioni, poiché il sottocampionamento riduce la precisione nel calcolo delle distanze.
