Um novo sistema alimentador-livre para produção em massa de murino Natural Killer Cells In Vitro

O objetivo geral deste novo sistema sem alimentador é fornecer um método para produzir em massa células assassinas naturais de alta pureza para ensaios in vitro e in vivo. Este método pode ajudar a responder às principais questões da imunologia inata, incluindo o desenvolvimento de células assassinas naturais e a imunidade ao câncer. A principal vantagem dessa técnica é que esse novo sistema sem alimentador pode aumentar amplamente a pureza das células assassinas naturais produzidas.

Isso facilita significativamente os seguintes ensaios in vitro e in vivo. A indicação desta técnica se estende à imunidade natural killer porque a produção em massa de células natural killer murinas pode ser produzida a partir da medula óssea de pacientes com câncer para análise e modificação para imunoterapia pessoal. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque o meio consumido deve ser coletado da célula OP9 em fase de crescimento.

A demonstração facial desse método é crítica, pois as etapas de instrução da medula óssea são difíceis de aprender, porque os ossos precisam ser estéreis com etanol com tempo ideal para preservar a viabilidade. Para iniciar este procedimento, colete as células OP9 de um frasco de cultura. Adicione FBS para interromper a digestão da tripsina.

Colete as células OP9 e centrifugue a 465 vezes a gravidade por cinco minutos. Depois disso, suspenda novamente o pellet celular. Usando um hemocitômetro, conte as células.

Em seguida, semeie duas vezes 10 a seis células em 15 mililitros de meio alfa-mem em um frasco de cultura de 75 centímetros quadrados e incube por 48 horas. Quando as células estiverem 80% confluentes, lave-as com 10 milímetros de solução salina tamponada com fosfato e adicione 20 mililitros de meio alfa-mem simples sem antibióticos e soro bovino fetal às células. Incubar por 24 horas.

No dia seguinte, colete o meio condicionado OP9 removendo os detritos celulares com um filtro e preserve a quatro graus Celsius. Injete uma overdose de 100 miligramas por quilograma de pentobarbital intraperitoneal para sacrificar um camundongo de 12 semanas de idade. Depois de confirmar a falta de respiração, excise os ossos do fêmur com uma faca cirúrgica.

Remova os músculos restantes coçando suavemente com uma lâmina. Transfira os ossos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros cheio de meio alfa-mem estéril resfriado e mantenha em um gabinete de biossegurança. Em seguida, expulse o meio alfa-mem e lave os ossos com etanol a 70% por 30 segundos.

Novamente, lave os ossos com solução salina tamponada com fosfato estéril gelado duas vezes para remover qualquer etanol restante. Após a lavagem, transfira os ossos para um almofariz contendo cinco mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado e fragmente os ossos com um pilão. Gire o pilão suavemente para liberar as células da medula óssea na solução salina tamponada com fosfato.

Transfira a solução salina tamponada com fosfato contendo células da medula óssea em um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue o tubo a 465 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante.

Extraia até que o osso fique branco para obter o rendimento máximo. Em seguida, ressuspenda o pellet com 18 mililitros de água destilada estéril e aguarde 30 segundos para remover os glóbulos vermelhos. Em seguida, adicione dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado 10X para interromper a reação.

Use um filtro de células de 70 micrômetros para remover os glóbulos vermelhos lisados. Em seguida, centrifugue os tubos a 465 vezes a gravidade por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 20 mililitros de solução salina tamponada com fosfato gelado.

Centrifugue as células mais uma vez. Em seguida, transfira o pellet celular em uma placa de Petri estéril de 100 mililitros contendo 10 mililitros de meio condicional OP9, suplementado com reagentes adicionais. Transfira a placa de Petri em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por duas horas.

Remova todas as células e sementes soltas em uma nova placa de cultura contendo meio condicional OP9 e coloque em uma incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. No quarto dia, substituir o meio de cultura por meio condicional OP9, suplementado com 20% de soro fetal bovino e 2.000 unidades por mililitro de interleucina murina 2. Continue trocando o meio de cultura a cada três dias até o sétimo dia para obter as células assassinas naturais maduras.

Siga o manual do produto para pré-misturar o pequeno RNA interferente ou controle sem sentido com o reagente de transfecção no zero, quarto e sétimo dia de troca do meio até o ponto final experimental. Adicione 50 nanomolares de pequeno RNA interferente, ou mistura sem sentido, às células soltas durante o refresco médio. Colete as células de diferenciação em um ponto de tempo apropriado.

Centrifugue as células a 465 vezes a gravidade por cinco minutos. Descarte o sobrenadante e lave o pellet celular com solução salina tamponada com fosfato gelado. Depois de lavar as células fixas com solução salina tamponada com fosfato gelado, ressuspenda as células em 100 microlitros de tampão de coloração por citometria de fluxo contendo anticorpos conjugados com SY3.

Depois disso, ressuspenda as amostras em 300 microlitros de solução salina tamponada com fosfato para análise por fax. Uma curva de crescimento representativa demonstrando a taxa de proliferação das células da medula óssea em diferenciação em células natural killer em sistema livre de alimentador. O gráfico mostra um aumento significativo na taxa de proliferação das células no sétimo dia.

Uma imagem representativa de campo brilhante mostrando células assassinas naturais diferenciadas em um novo sistema livre de alimentador. As células natural killer maduras exibiram alta proporção nuclear para citoplasmática com uma morfologia citoplasmática granular. Um gráfico de barras representativo mostrando o efeito de pequenos RNAs interferentes nas células da medula óssea submetidas à diferenciação em células assassinas naturais no sexto dia.

O gráfico mostra uma redução significativa nos níveis de mRNA de E4bp4 e pequenas células natural killer tratadas com RNA interferente em comparação com o grupo controle. Dados de citometria de fluxo representativos demonstrando o efeito de E4bp4 silenciado na diferenciação de células natural killer derivadas da medula óssea de maneira dependente de TGF beta-1 Smad3. Os dados mostram que o knockdown do mRNA de E4bp4 diminui muito na produção de células assassinas naturais maduras no sexto dia em comparação com o controle sem sentido.

Pequena produção diminuída mediada por RNA interferente de células assassinas naturais é resgatada pela supressão de TGF beta-1 Smad3 com um inibidor micromolar de SIS3 Smad3 em comparação com o pequeno grupo transfectado de RNA interferente. Uma vez dominado, este estudo pode ser feito em duas horas se for realizado corretamente. Seguir este procedimento permite que modificações genéticas, como bloqueio de genes e superexpressão, possam ser conduzidas para responder a perguntas adicionais, como os mecanismos de regulação da atividade das células assassinas naturais, bem como o desenvolvimento.

A primeira eu tive a ideia para esse método quando estava expandindo as células assassinas naturais no sistema antigo. A presença das células fetais diminuiu a carga e a eficiência do siRNA para o gene de interesse. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir células assassinas naturais massivas de alta qualidade a partir deste sistema local in vitro.

Não se esqueça de que trabalhar com reagentes de extração de RNA pode ser extremamente perigoso e sempre devem ser tomadas precauções ao realizar este procedimento.